口疮穴位贴主要成分的鉴别与含量测定*

倪玉佳，李 敏，陈 颖，董文燊，瞿发林

1 第904 医院常州医疗区 药剂科，常州 213000；2 南京中医药大学 翰林学院，泰州 225300；3第904 医院 药剂科，无锡 214000

口疮是常见的口腔黏膜疾病[1]。中医认为人体是一整体，各五脏六腑与组织器官之间存在紧密的关系，还包括生理与病理的各个方面[2]。在《素问·阴阳应象大论》中，有“脾主心”、“心主舌”的理论，认为口疮由心脾经蕴热所致[3]。而穴位贴能有效地刺激足底涌泉穴，使药性经皮毛腠理渗入，药力直达病灶，同时通过经络运行传至相应脏腑，从而治愈口腔溃疡[4]。

口疮穴位贴源于第904 医院一临床经验方，由吴茱萸、大黄、川黄连等5 味药材组成的贴膏剂，具有清热泻火、温助脾肾等功效，在临床上治疗口疮效果显著、应用方便。为确保该贴剂质量可靠，本试验对两味主要药材吴茱萸和大黄进行定性定量考察。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

ATX124 电子天平（岛津公司）；Waters2487 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ZF-20D 暗箱式紫外分析仪（英峪予华仪器厂）。

1.2 药品与试剂

口疮穴位贴（批号：20190705、20190715、20190723、20200307、20200404、20200516、20200613、20200711，含膏量1.8 g/贴），实验室自制。

对照品：吴茱萸碱、吴茱萸次碱、大黄素（批号分别为110802-201710、110801-201608、110756- 201913；纯度分别为：99.6%、99.7%、96.0%）；对照药材：吴茱萸、大黄（批号分别为120909-201510、120984-201202），均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯；三乙胺、乙醇、石油醚、盐酸、磷酸、无水硫酸钠、乙酸乙酯为分析纯；纯化水。

2 方法与结果

2.1 吴茱萸的鉴别

取贴剂（批号：20190705），除去盖衬，精密称取1g，加95%乙醇10 mL，摇匀并置于具塞锥形瓶，静置30 min，超声处理（30 ℃，100 Hz，30 min），过滤后即为供试品溶液①；另取阴性（缺吴茱萸）样品1 g，按溶液①制备流程制成溶液②；分别取吴茱萸次碱、吴茱萸碱适量，加95%乙醇制成3.0、4.0 mg·mL-1的溶液③、④；取对照药材吴茱萸0.4 g，按溶液①制备流程制成溶液⑤。吸取上述①②③④⑤溶液，分别为6、6、1、3、7 μL，在硅胶板（G）上进行点样，选择乙酸乙酯-三乙胺-石油醚（60～90 ℃）为展开剂，按3∶0.1∶7 比例，展开完成后于365 nm 紫外光下观察[5]。见图1。结果显示，供试品与吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸药材在相同位置上，显现相同荧光斑点，其他成分无干扰。

图1 吴茱萸的薄层图谱

2.2 大黄的鉴别[6]

取贴剂（批号：20190705），除去盖衬，精密称取2 g 于锥形瓶中，加20 mL 甲醇，超声处理（30 ℃，100 Hz，30 min），取其续滤液5 mL 蒸干，加10 mL 水溶解固体物，再加盐酸1 mL，回流30 min 后，即刻冷却至室温，萃取2 次（乙醚20 mL/次），合并萃取液并蒸干，加二氯甲烷1 mL 使固体物溶解，过滤，滤液即为供试品溶液①[6]；另取阴性（缺大黄）样品2 g，按溶液①制备流程制成阴性溶液②；取对照品大黄素适量，加甲醇制成1 mg·mL-1溶液③；另取对照药材大黄0.2 g，按溶液①制备流程制成溶液④。吸取上述①、②、③、④溶液7、7、1、7 μL，在硅胶板（G）上点样，冰乙酸-石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯（1.2∶18∶5）为展开剂，展开，完成后于365 nm 紫外光下及氨气熏蒸后观察，见图2。结果显示，供试品与大黄药材、大黄素在相同位置上，显现相同荧光斑点，氨气熏蒸后荧光斑点显红色。阴性溶液紫外检视图中斑点易混淆，氨气熏蒸后干扰斑点消失，其他成分无干扰。

图2 大黄的薄层图谱

2.3 吴茱萸的含量测定

2.3.1 色谱条件色谱柱：Lichrosphe C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：水-乙腈（53∶47）；柱温：30 ℃；检测波长：225nm；流速：1.0mL·min-1；进样量：20 μL。理论塔板数按吴茱萸碱计不低于2000。

2.3.2 溶液的制备对照品溶液（A）：精密称取对照品吴茱萸碱、吴茱萸次碱适量，加甲醇制成含吴茱萸碱（83.7 μg·mL-1）、吴茱萸次碱（46.3 μg·mL-1）的混合对照品溶液。

供试品溶液（B）：取贴剂，除去盖衬后，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，加入70%乙醇25 mL，密塞称定重量，超声处理（100 Hz，40 min），冷却至室温，称定后用70%乙醇补足失重，摇匀过滤，即得滤液[5]。

阴性溶液（C）：按口疮穴位贴剂处方制备缺吴茱萸的样品，同溶液（B）的制备流程制备阴性溶液。

2.3.3 专属性考察按“2.3.1”项下色谱条件，分别测定溶液A、B、C，由图3 可知，1、2 与相邻色谱峰的分离度较好，阴性无干扰。

图3 吴茱萸HPLC 色谱图

2.3.4 线性关系考察精密吸取“2.3.2”项下的吴茱萸碱与吴茱萸次碱对照品储备液适量，分别制成含吴茱萸碱3.3、6.7、16.7、83.7、167.3 μg·mL-1系列浓度，吴茱萸次碱1.9、3.7、9.3、46.3、92.5 μg·mL-1系列浓度，依次进样，记录其对应的峰面积。以横坐标为吴茱萸碱、吴茱萸次碱的进样浓度，纵坐标为其峰面积，得回归方程分别为：Y 吴茱萸碱=2.512 6×104X－1.407 4×104（n=5，r=0.999 8）；Y 吴茱萸次碱=1.503 3×104X-7.064 7×103（n=5，r=0.999 8）。结果显示，吴茱萸碱在3.3～167.3 μg·mL-1、吴茱萸次碱在1.9～92.5 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验精密吸取对照品溶液适量（A）进样6 次，记录其对应峰面积，计算吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积RSD 分别为0.84%、0.53%。表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验取同一批贴剂样品（批号：20190705）溶液20 μL，分别于0～20 h 连续进样（间隔4 h/次），按“2.3.1”色谱条件测定。RSD 测定结果分别为1.48%和1.52%，表明溶液20 h 内稳定。

2.3.7 重复性试验取同一批贴剂样品（批号：20190705），按供试品溶液（B）制备方法制备6 份供试品溶液，按“2.3.1”色谱条件测定，记录其对应峰面积，根据外标法（对照品比较法）分别计算得到吴茱萸碱、吴茱萸次碱的平均含量为1.096、0.662 mg·g-1，RSD分别为0.76%、0.87%，表明该法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验精密称取已知含量的口疮穴位贴剂0.5 g（批号20190705），依次加入吴茱萸碱、吴茱萸次碱混合对照溶液适量（按50%、100%、150%比例），照“2.3.2”项下平行制备9 份，按“2.3.1”色谱条件进行测定。表明该方法准确度较好。计算得吴茱萸碱、吴茱萸次碱的平均回收率分别为98.13%、99.58%，RSD 分别为1.98%、1.37%。

2.4 大黄的含量测定

2.4.1 色谱条件与系统适用性要求色谱柱：Lichrosphe C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液-甲醇（35∶28∶37）；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。理论塔板数按大黄素峰计不低于2000。

2.4.2 溶液的制备对照品溶液（Ⅰ）：精密称取对照品大黄素适量，加甲醇溶解制成含大黄素的对照品储备液（118.6 μg·mL-1）。

供试品溶液（Ⅱ）：取贴剂，除去盖衬后，精密称取2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1h，取出冷却至室温后用甲醇补足重量，摇匀并过滤。精密量取续滤液5 mL 后蒸干，加8%盐酸溶液20 mL 溶解固体物，再加入25 mL二氯甲烷，加热回流30 min（水浴），即刻冷却至室温，移至分液漏斗中，用50 mL 二氯甲烷进行萃取3次（20 mL+15 mL+15 mL），合并收集二氯甲烷液。以无水硫酸钠进行脱水，再次回收二氯甲烷至蒸干，用适量甲醇溶解固体物后转移至25 mL 量瓶中，甲醇定容并摇匀，即为供试品溶液（Ⅱ）。

阴性溶液（Ⅲ）：按口疮穴位贴剂处方制备缺大黄的样品，同供试品溶液（Ⅱ）制备流程制备阴性溶液。

2.4.3 专属性考察按“2.4.1”项下色谱条件分别测定溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。由图4 可知，大黄素与相邻色谱峰的分离度较好，阴性无干扰。

图4 大黄HPLC 色谱图

2.4.4 线性关系考察精密吸取“2.4.2”项下的大黄素对照品储备液适量，分别制成大黄素1.2、2.4、4.7、11.9、23.7、118.6 μg·mL-1系列浓度，依次进样测定，记录其对应的峰面积，最终横坐标为大黄素的进样浓度，纵坐标为其峰面积，得回归方程为Y 大黄素=7.892 9×104X+9.911 6×103（n=6、r=0.999 9）；大黄素在1.2～118.6 μg·mL-1范围线性关系良好。

2.4.5 精密度试验精密吸取大黄素对照品溶液，重复进样6 次，记录其对应峰面积，计算大黄素峰面积RSD 为0.74%。表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验取同一批贴剂样品（批号：20190705）溶液20 μL，分别于0～20 h 连续进样（间隔4 h/次），按“2.4.1”项下色谱条件进样测定。RSD测定结果为1.73%，表明样品溶液20 h 内稳定。

2.4.7 重复性试验取同一批样品（批号：20190705），按溶液（Ⅱ）方法制备6 份，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录其对应峰面积，按外标法计算（对照品比较法）大黄素的平均含量为145.39 μg·g-1，RSD 为1.85%，表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验精密称取已知含量的口疮穴位贴1.0 g（批号20190705），依次加入大黄素对照溶液适量（按50%、100%、150%的比例），照“2.4.2”项下平行制备9 份进行测定。表明本方法准确度较好。根据对照品比较法计算得大黄素的平均回收率为97.77%，RSD 为1.63%。

2.5 样品含量测定

分别取8 份不同批次的口疮穴位贴适量，按供试品制备方法分别制备供试品溶液，按 “2.3.1”和“2.4.1”项下的色谱条件分别进样，每个样品平行测定2 份，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、大黄素的峰面积，按外标法（对照品比较法）计算其平均含量。见表1。

表1 样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 薄层色谱条件的优化

本实验为使展开剂配制简单，缩短实验流程，提高工作效率，即参考相关文献[5，6]，同时考察了多个展开剂体系[7]，包括石油醚-二氯甲烷-冰乙酸（9∶5∶0.5）；石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸（9∶2∶0.6）、（18∶5∶1）、（18∶5∶1.2）、（18∶5∶1.5）。最终选定最佳展开条件为石油醚-乙酸乙酯-冰乙酸（18∶5∶1.2）。

3.2 提取条件的考察

吴茱萸生物碱属于脂溶性化合物，易溶于有机溶剂[8]。本研究考察了不同提取溶剂（60%、70%、80%、95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯）以及有无浸泡过程对试验的影响。最终选定以70%乙醇超声40min 提取效果最佳，且采用的提取溶剂安全环保，耗时较短。

3.3 含量限度的制定

根据含量测定的结果，考虑到药材的质量会受其产地、来源、加工方式等差异的影响[9-11]，故以该8批贴剂的含量平均值向下浮动25%，同时参照《中国药典》中原药材的含量作为口疮穴位贴中吴茱萸碱、吴茱萸次碱及大黄素的含量下限，暂定本品每贴剂含吴茱萸以吴茱萸碱与吴茱萸次碱合计不得少于2.4 mg；含大黄以大黄素计不得少于0.2 mg。