Pseudomonas sp. J1生物合成纳米硒机制研究

2022-05-07 11:14张小萱任国栋刘畅陶文超张笑迎刘欢闵婷梅运军

广西大学学报（自然科学版） 2022年1期

张小萱，任国栋，刘畅，陶文超，张笑迎，刘欢，闵婷，梅运军*

(1.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学电气与电子工程学院，湖北武汉 430023；3.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023)

0 引言

硒在人体代谢中扮演重要角色，不仅具有防肿瘤、抗氧化、防衰老及调节免疫等作用[1-7]；而且与多种疾病相关[8-11]。1973年，世界卫生组织将硒列入人体生理必需的微量元素，我国卫生部在1994年也将硒列为营养强化剂。

由于硒在体内不能自身合成，因此在缺硒时只能靠外部摄取补充。市面曾流行两大类补硒产品，即无机硒类和有机硒类补硒剂。无机硒类补硒剂中亚硒酸钠补硒剂应用最为广泛；但无机硒类补硒剂存在生物安全隐患，因此逐渐退出了市场。相较于无机硒，有机硒的生物活性好，毒性低且副作用小，因此有机硒类补硒剂逐渐占据了市场，其产品主要有硒氨基酸、硒肽、硒蛋白、硒核酸、富硒生物等。但随着对硒研究的逐步深入，研究者发现纳米硒具有特殊的理化性质，如生物吸收性好、活性强且毒性更低，生物安全性高于无机及有机硒，是一种潜在的新型补硒产品，在食品、医药方面应用前景良好。纳米硒合成方法包括物理法、化学法及生物法。微生物合成纳米硒条件温和且纳米硒稳定性及分散性好，近年来受到了研究者的广泛关注[12]。能够进行纳米硒生物转化的微生物种类多样，细菌包括嗜麦芽寡养单胞菌[13]、棒状菌属[14]、乳酸菌属[15]、假单胞菌属[16]、芽孢杆菌属[17]等，真菌包括霉菌类[18]，有真核酵母菌[19]等。原生动物也可合成纳米硒，但目前仅报道嗜热四膜虫有此能力[20]。微生物合成纳米硒表现出了良好势头，但筛选适用于工业化生产的高产菌株以及发酵过程参数控制一直是困扰工业生产的主要问题。

Pseudomonassp. J1分离自富硒矿区，具有较高的亚硒酸钠耐受性[21]。本文在前期工作基础上，探讨Pseudomonassp. J1生物合成纳米硒的机制和发酵条件，以期为其工业应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

菌株分离自湖北省恩施州富硒矿区地理位置为(109.785 9°E，30.181 3°N)，经鉴定为Pseudomonas[21]，命名为Pseudomonassp. J1。

1.2 实验试剂

蛋白胨购(OXIOD)、酵母抽提物(OXIOD)、琼脂粉(Biosharp)、亚硒酸钠(Alfa)、谷胱甘肽抑制剂(丁硫氨酸-亚砜亚胺)(Sigma)，谷胱甘肽检测试剂盒(碧云天)，其他试剂购自国药集团，所有试剂均为分析纯。

1.3 仪器设备

能量散射X射线能谱仪(JEM-ARM200F型，日本电子公司)；扫描电镜(JEOL 7600F型，日本电子公司)；双道氢化物发生原子荧光分光光度(AFS820型，北京吉天公司)；真空冷冻干燥机(D-1A-50型，天翎仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 发酵培养基及培养

将过滤除菌的亚硒酸钠溶液添加至灭菌的LB液体培养基中，使其终质量浓度为5 g/L，作为发酵培养基。

将Pseudomonassp. J1新鲜培养物按照体积分数为2%接种量接种至发酵培养基中，恒温摇床培养(温度30 ℃，转速180 r/min)，作为实验组；对照组发酵培养液中不添加亚硒酸钠，其他培养条件参照实验组。对照组与实验组分多组分别用于后续试验。

1.4.2 电镜制样及测试

分别取培养48 h的培养物(对照组、实验组)4 mL于12 000 g离心5 min，收集沉淀，并用pH=7.4的PBS重悬并清洗3次；然后将样品在体积分数为2.5%的戊二醛溶液中固定24 h(4 ℃)；固定后样品均分为2份，一份送中科院武汉病毒所测试中心制备超薄切片并进行透射电镜分析，另一份送武汉铄思百检测技术有限公司进行XPS及EDS分析。

1.4.3 硒含量测定

硒含量测定采用GB 5009.93—2010标准中的氢化物原子荧光光谱法[22]。

1.4.4 谷胱甘肽含量分析

对照组、实验组培养48 h后离心收集菌体，并用pH=7.4的PBS对收集菌体清洗3次，然后用试剂盒(S0052型，碧云天，上海)提供的说明对菌体谷胱甘肽含量进行测试。

1.4.5 谷胱甘肽合成抑制实验

在另一组对照组、实验组实验中，在接种菌的同时添加过滤除菌的谷胱甘肽抑制剂至终浓度为0.5 mmol/L，培养条件同上，培养48 h后测定溶液中硒及细胞内谷胱甘肽含量。

1.4.6 亚硒酸钠浓度对转化效率的影响

向LB培养基中添加过滤除菌的亚硒酸钠至指定浓度，培养条件如上；48 h后取4 mL培养物12 000 g离心10 min并收集上清；收集后的上清用孔径为0.2 μm的滤膜过滤，收集滤液并测硒含量，计算转化效率。

向发酵培养基中添加硝酸钾至指定浓度，其余培养条件及时间如上，后续处理方式参照1.4.6进行。

1.4.8 温度对转化效率的影响

将发酵培养基中的培养物在指定的温度下培养，其余培养条件及时间如上，后续处理方式参照1.4.6进行。

1.4.9 实验数据处理

实验均设置3个平行样，采用Origin 8.0进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 纳米硒的生物合成

将Pseudomonassp. J1分别接种到未添加亚硒酸钠和添加亚硒酸钠的LB培养基中进行发酵培养，48 h后分别离心收集沉淀获得培养物，培养物固定化后进行EDS分析，纳米硒的生物合成结果如图1所示。图1(a)至图1(f)为未添加亚硒酸钠的培养物扫描电镜及EDS测试结果(对照组)，图1(a′)至图1(f′)为对应的实验组测试结果。比较图1(a)与图1(a′)培养物的扫描电镜不难看出，在实验组的Pseudomonassp. J1细胞[图1(a′)中粗箭头所示]周围聚集有大量的球型颗粒物[图1(a′)中细箭头所示]，而在对照组的细胞[图1(a)中粗箭头所示]周围无任何颗粒物质。对图1(a)及(a′)紫色标记区域进行元素EDS分析，结果分别如图1(b)及(b′)，元素组成的EDS分析结果显示实验组培养物中含有元素硒 [图1(b′)]而对照组不含有硒元素[图1(b)]；该区域部分元素质量分数及原子数分数如表1所示，对照组中Se元素质量分数和原子数分数都为0，而对照组中Se元素质量分数和原子数分数分别为1.04%和0.28%。培养物元素分布分析结果[图1(c)—(f)及图1(c′)—(f′)]进一步证实硒元素只存在于实验组中，且扫描电镜[图1(a′)]与硒元素分布的EDS[图1(f′)]结果十分吻合。以上结果证实聚集在细胞周围的颗粒物含有硒，且颗粒物粒径在100～200 nm。

(a)未加亚硒酸钠培养物SEM图像

表1 局部区域部分元素质量分数及原子数分数Tab.1 Percentage of element mass and atomic number in a local area

2.2 含硒颗粒物的XPS分析

在亚硒酸钠发酵培养基中的培养物经离心、PBS漂洗后的沉淀冷冻干燥后进行Se 3d的XPS扫描分析，颗粒物XPS扫描图如图2所示。在图谱中出现了Se 3d电子结合能的峰[图2(a)]，利用XPS Peak软件对Se 3d峰进行分峰拟合，得到图2(b)，Se 3d5的峰在55.49 eV，Se 3d3的峰则在56.24 eV处。据文献报道[23]，Se(Ⅳ)的Se 3d峰结合能大于58.0 eV，单质硒约为54.6～57.5 eV之间，硒化合物为约52.8～55.7 eV；本研究中Se 3d5、Se 3d3结合能介于Hand[23]报道的54.6～57.5 eV之间，所以本研究中颗粒物为单质硒。结合EDS测试分析结果，聚集在Pseudomonassp. J1细胞周围的颗粒物质为生物纳米硒，即Pseudomonassp. J1将亚硒酸钠还原为单质硒。

(a)颗粒物的Se 3d XPS扫描图

2.3 纳米硒的合成机制

2.3.1Pseudomonassp. J1胞内合成纳米硒

在微生物生长过程中，微生物会利用环境中高价态硒(Se4+或Se6+)作为电子受体，在细胞外将化合态的硒转化为单质硒粒子，而有些微生物则在胞内将硒酸钠或亚硒酸钠转变为单质纳米硒，然后用特殊机制将胞内纳米硒排出胞外[24]。为了揭示Pseudomonassp. J1菌株合成纳米硒的方式，通过对超薄切片的电镜检测观察到该菌由胞内合成纳米硒然后向胞外释放的过程，Pseudomonassp. J1培养物的超薄切片如图3所示。

(a)未加亚硒酸钠培养物

图3(a)为未添加亚硒酸钠的Pseudomonassp. J1培养物的超薄切片电镜图像，图3(a)中细胞结构完整，胞内未见明显颗粒物；而在添加亚硒酸钠的Pseudomonassp. J1培养物的超薄切片中，胞内含有纳米硒颗粒物[图3(b)、(c)中黑色箭头所示]，视野中同时有排出胞外的纳米硒颗粒[图3(c)中最右图白色箭头所示]。有文献报道，有些细菌对亚硒酸钠的还原是依赖周质空间中非特异性亚硒酸盐还原酶系统作用，将亚硒酸盐还原为单质硒，还原过程中生成的红色纳米硒会积累在细胞质和细胞外[25]，而从Pseudomonassp. J1超薄切片的透射电镜图像可以证实Pseudomonassp. J1菌株还原亚硒酸钠生成纳米硒是在胞质内合成并向胞外运输的一种方式，与Piacenza[26]等报道Ochrobactrum sp. MPV1合成纳米硒方式一致，但不同于Butler等[25]及Schrdöer等[27]报道Thauera selenati在细胞间质中合成纳米硒而向胞外转运的方式。Pseudomonassp. J1如何转运其机制尚不清楚，需要进一步研究。

2.3.2 谷胱甘肽抑制剂对Pseudomonassp. J1合成纳米硒的影响

谷胱甘肽对微生物转化亚硒酸钠生成纳米硒有直接的关系，而丁硫氨酸-亚砜亚胺作为谷胱甘肽合成酶的抑制剂会影响细胞内谷胱甘肽的水平[20，28-29]。为了证实Pseudomonassp. J1合成纳米硒是否与谷胱甘肽有关，通过向发酵培养基中添加丁硫氨酸-亚砜亚胺，监测Pseudomonassp. J1胞内谷胱甘肽水平与Pseudomonassp. J1对亚硒酸钠转化效率间的关系，从而揭示谷胱甘肽在纳米硒合成中的作用，谷胱甘肽抑制剂对Pseudomonassp. J1转化亚硒酸钠的影响如图4所示。从图4(a)可以看出，在发酵培养基中培养的Pseudomonassp. J1胞内谷胱甘肽浓度最高，为(21.73±0.91) μmol/mg；其次为不添加亚硒酸钠的培养基中培养的Pseudomonassp. J1，为(16.03±0.71) μmol/mg；在有抑制剂的发酵培养基中培养的Pseudomonassp. J1中最低，为(9.5±0.92) μmol/mg，对实验数据t检验显示，3种处理差异显著(P<0.01)；说明向培养基中添加亚硒酸钠促进了谷胱甘肽合成酶表达，从而导致Pseudomonassp. J1胞内积累了更多的谷胱甘肽，而添加了丁硫氨酸-亚砜亚胺抑制剂后抑制了谷胱甘肽合成酶的活性，降低了谷胱甘肽的合成速率，显著影响了胞内谷胱甘肽的积累。

图4(b)展示了2种处理方式对Pseudomonassp. J1转化亚硒酸钠效率的影响。在正常发酵培养基中，亚硒酸钠的转化效率为(47.73±2.15)%；在添加了丁硫氨酸-亚砜亚胺后，Pseudomonassp. J1对亚硒酸钠的转化效率明显下降，为(13.47±1.36)%。该结果结合图4(a)结果共同表明，谷胱甘肽是Pseudomonassp. J1还原亚硒酸钠为纳米硒的主要途径，该结果与以往报道谷胱甘肽参与微生物还原亚硒酸钠结果一致[20，28-29]。另有研究表明,Rhodobactersphaeroides、Paracoccusdenitrificans、Pseudomonasseleniipraecipitans等微生物胞内硝酸盐还原酶也参与了Se(VI)的还原[30-31]，关于Pseudomonassp. J1是否有其他途径参与还原Se(VI)还需要在以后的工作中进一步展开。

样品样品

2.4 培养条件对转化效率的影响

2.4.1 亚硒酸钠浓度对转化效率的影响

亚硒酸钠对Pseudomonassp. J1 转化效率的影响如图5所示，由图5可知，Pseudomonassp. J1还原亚硒酸钠为纳米硒的效率随着向培养基中添加亚硒酸钠浓度增加而下降，且亚硒酸钠浓度对转化效率的影响显著(P<0.01)。在含有质量浓度为30 g/L的亚硒酸钠的发酵培养基中，Pseudomonassp. J1对亚硒酸钠转化效率仅为(0.19±0.02)%，低浓度组(5 g/L亚硒酸钠)转化效率为(47.73±2.15)%，且高浓度组(30 g/L亚硒酸钠)发酵培养物中Pseudomonassp. J1细胞浓度明显降低(结果未显示)。该结果表明，亚硒酸钠对Pseudomonassp. J1具有明显的细胞毒性作用，在高浓度时不利于细胞生长，因此，在利用Pseudomonassp. J1生物合成纳米硒时需要进一步对底物(亚硒酸钠)浓度进行优化，充分考虑转化效率与生产量之间的关系。