pH依赖-时控型大黄素结肠定位微丸的药动学研究

叶晓莉，高 越，宋 清，陈 玲，吴梅君，王丛瑶，王彬辉

(1浙江省临床肿瘤药理与毒理学研究重点实验室，浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院·浙江 杭州 310006；2浙江省立同德医院·浙江 杭州 310053；3台州学院医学院附属市立医院·浙江 台州 318000；4杭州市萧山区第一人民医院·浙江 杭州 311200)

大黄素(Emodin, Emo)为中药大黄中提取的一种蒽醌类衍生物，具有抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等作用，能有效治疗结肠肿瘤[1-5]。然而大黄素半衰期短，难溶于水，很难通过血液运输被机体肿瘤组织吸收，导致口服生物利用度低，制约了大黄素制剂开发与临床应用[6-7]。

微丸又称小丸(pellets)，是指直径约为0.5～1.5 mm的小球状口服固体制剂。属于一种多单元剂量分散型制剂，通常一个剂量由几十至几百个微丸组成，个别微丸制备上的缺陷不会对微丸整体造成影响。食物输送节律不会影响其转运过程，具有吸收均匀、生物利用度高等特点[8-9]。研究表明药物通过结肠的时间与其体积成反比，因此，微丸是近年来制备口服结肠定位给药系统(oral colon specific drug delivery systems, OCDDS)较为理想的剂型。本实验以大黄素为模型药物，采用离心造粒包衣机以粉末层积法设计了时滞型与pH依赖相结合的结肠定位给药微丸；SD大鼠尾静脉给药，采用HPLC法研究载药微丸在大鼠体内的药动学，为大黄素结肠肿瘤靶向新型给药系统提供实验依据和理论参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；LLB-400型离心流动型包衣造粒机：成都永泰制药化工机械厂；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂；TGL-16B高速台式离心机：上海安亭科学仪器有限公司。

1.2 药品和试剂 大黄素(纯度>95%)：成都农兴生物科技有限公司，批号：LX-090320-5；大黄素对照品：中国药品生物制品检定所，批号：110756-2004110；肝素钠：常州千红生化制药股份有限公司，批号：120308；甲醇和乙腈均为色谱纯。

1.3 实验动物 清洁级健康成年SD大鼠，雌雄各半，体质量(280±10)g，浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号SYXK(浙)2013-0184。所有动物实验均符合本校动物饲养和使用指南。

2 方法

2.1 pH依赖-时控型大黄素微丸的制备

2.1.1 时滞微丸包衣 时滞层包衣液最佳处方：时滞层材料Eudragit RL 30D增重5%，致孔剂HPMC用量60%，抗黏剂滑石粉用量50%，增塑剂柠檬酸三乙酯用量15%。取500 g载药微丸，置离心造粒包衣机内，开启设备。仪器开启参数为：主机转速100 r/min，喷气压力0.3 MPa，浆泵转速9.0 r/min，包衣温度35 ℃。包衣过程中持续搅拌包衣液，包衣结束后，40 ℃塑化12 h，筛分出18～24目微丸。

2.1.2 pH依赖微丸包衣 pH依赖层包衣液最佳处方：pH依赖层材料Eudragit FS 30D增重4.6%，抗黏剂滑石粉用量50%，增塑剂柠檬酸三乙酯用量5%。称取适量时滞层微丸，置离心造粒包衣机内，继续进行外层包衣，按“2.1.1”项下时滞微丸包衣的工艺参数开启仪器。待包衣液喷完后，加入微粉硅胶2.0 g，40 ℃塑化6 h，即得pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸。

2.2 药动学

2.2.1 大黄素对照品溶液的配制 精密称取Emo对照品适量，用甲醇溶解定容置100 mL容量瓶中，作为对照品溶液。

2.2.2 血浆处理 大鼠血浆300 μL以1∶1加入等量30 % H2SO4，旋涡振荡30 s，(70±2)℃水浴锅中水解30 min。待冷却加600 μL乙醚，旋涡3 min离心(10 000 r·min-1，5 min)，倾出乙醚层后在剩余水相中加入乙醚600 μL同法再萃取1次，合并乙醚液N2吹干，残渣加甲醇100 μL溶解。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.1磷酸溶液(75∶25)；流速：1 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃;进样量20 μL。

2.2.4 专属性考察 取空白血浆、空白血浆+大黄素对照品溶液、口服pH依赖-时控型大黄素微丸血浆，考察其专属性，结果见图1。色谱峰专一、灵敏，且峰形良好，内源性物质无干扰。大黄素的保留时间约为13.89 min。

图1 高效液相色谱图(1.大黄素)

2.2.5 标准曲线的建立 空白血浆中加入大黄素对照品溶液，得系列浓度：0.514、2.056、5.14、10.28、20.56、30.84、51.4 mg·L-1，用HPLC测定，以峰面积(Y)对浓度(C)进行线性回归，得标准曲线方程：Y=22.173+30.173 C(n=7)(r=0.9994)。

2.2.6 重复性试验 为保证在选用的色谱条件下大黄素定量分析的准确性，分别考察大黄素的保留时间及峰面积的重复性。分别选择标准曲线线性范围的中间浓度点连续进样5次，结果大黄素的保留时间、峰面积的RSD分别为0.18%和0.82%。

2.2.7 精密度试验 制备质量浓度分别为51.4、20.56、0.514 mg·L-1的大黄素血浆对照品溶液，同一天内测5次，连续5 d各测1次，计算日内及日间精密度，日内及日间精密度RSD分别少于1.25%和1.91%，符合要求。

2.2.8 方法回收率试验 制备质量浓度分别为0.514、20.56、51.4 mg·mL-1的大黄素血浆对照品溶液，每个浓度平行进3针，测定方法回收率。方法回收率分别为92.99±1.92(RSD=2.06)、94.36±3.68(RSD=3.90)、95.97±2.46(RSD=2.56)，符合要求。

2.2.9 稳定性试验 制备质量浓度分别为51.4、20.56、0.514 mg·L-1的大黄素血浆对照品溶液，每个浓度平行进3针，常温稳定性RSD少于2.0%，符合要求。

2.2.10 给药及采样 实验共分两组，大黄素溶液组和pH依赖-时滞型大黄素微丸组，每组各6只SD大鼠，分别口服给药200.0 mg·kg-1(以大黄素量计算)，并通过股动脉插管取血，血浆置于肝素化的离心管中，离心10 min (13 000 r·min-1)，分离血浆，-70 ℃保存。

对照组：给予大黄素原料药，称取大黄素原药适量，配制成混悬液，大鼠灌胃给予大黄素混悬液适量，分别于给药后0.083、0.167、0.25、0.5、l、2、3、4、5、6、8、12、16 h取血0.5 mL。实验组：给予pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸，经口插入聚乙烯管(直径4 mm)，通过聚乙烯管给大鼠口服微丸适量，分别于给药后l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16 h取血0.5 mL。

3 结果

3.1 pH依赖-时滞型大黄素微丸的理化性质 pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸圆整度好，粒径分布均匀，且包衣膜厚度均一，不易发生微丸间药物释放的显著差异。

3.2 pH依赖-时滞型大黄素微丸的药动学 以时间为横坐标，血药浓度为纵坐标，绘制大黄素溶液和pH依赖-时滞型大黄素微丸药-时曲线。见图2。采用DAS2.0 药动学软件进行统计矩分析处理，计算药动学参数，见表1。并采用SPSS16.0软件进行方差检验，P<0.05认为有显著性差异。

图2 大黄素溶液和pH依赖-时滞型大黄素微丸药-时曲线(动物数：6)

由图1和表1可知，大鼠口服pH依赖-时滞型大黄素微丸后，药物在体内的半衰期(T1/2)、达峰时间(Tmax)和滞留时间(MRT)均延长，说明结肠靶向微丸进入大鼠体内释放相对缓慢，具有一定的缓释作用，延长了体内作用时间，pH依赖-时滞型微丸延长了其体内滞留时间，改变了其药动学行为。

表1 大黄素溶液和pH依赖-时滞型大黄素微丸药动学参数

4 讨论

口服结肠定位给药系统(OCDDS)作为一种新型给药系统具有广阔的应用前景，通过增加药物在结肠部位的局部浓度，避免药物在胃及小肠的吸收，可有效治疗结肠癌、过敏性肠道综合征和炎症性肠道疾病，使药物富集于病变部位发挥作用，提高治疗效果，减少不良反应[10-11]。本文采用离心造粒包衣技术，首先制备了MCC空白丸芯，然后在空白丸芯表面层积药物层(大黄素)，得到大黄素素丸；最后对大黄素素丸进行两层包衣：内层采用Eudragit RL 30D水分散体作为时滞层材料对大黄素素丸进行包衣，制备时滞微丸；再外层采用Eudragit FS 30D水分散体作为pH依赖层材料对时滞微丸进行包衣，即得pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸。大鼠灌胃给予微丸后，对其进行药物动力学研究，探讨pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸在大鼠体内的释药特性。

采用大鼠作为实验动物研究结肠定位微丸体内药动学时，给药方法是一大难题。灌胃针仅仅适合于溶液、混悬液的给药，并不适合给予本课题的微丸。因为制备的微丸具有较大的粒径，而常规的灌胃针针头直径较微丸的直径小，为了保证微丸在不被破坏的前提下能完整的到达动物体内，故在灌胃给予pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸时，采用在大鼠口中插入适宜大小的聚乙烯管(直径4 mm)，依靠聚乙烯管的柔韧性及微丸良好的流动性，保证了灌胃至大鼠体内的微丸是完整的，确保了药动学研究的准确性。

从图2可知：大鼠灌胃给予pH依赖-时滞型结肠定位微丸和大黄素溶液后，实验组在给药4 h后才检测到大黄素，达峰时间在7 h，峰浓度为(3.84±0.12) mg·L-1，给微丸后6～12 h的血药浓度保持在2～4 mg·L-1。对照组给药后，药物吸收较快，1 h即达到最高峰，峰浓度为(12.81±0.47)mg·L-1，随后快速消除，6 h时血液中的药物浓度低于2 mg·L-1。可以判断，制备得到的微丸具有结肠定位的特征，并且血药浓度较为平稳，可以持续释放6 h以上，有利于结肠部位疾病的治疗。

从药动学参数可知：实验组平均滞留时间(MRT)为(16.42±3.19) h，而对照组平均滞留时间(MRT)为(2.71±0.20) h，实验组的MRT为对照组6倍；实验组和对照组AUC0-∞无明显差别。实验组的Tmax较对照组延长6 h；表明制备的pH依赖-时滞型大黄素微丸提高了大黄素在体内的吸收程度，延长了药物在血液中的循环时间，起到缓释作用。微丸经口服依次通过胃、小肠到达结肠部位的平均时间约为5～6 h[12]；因此，制备得到的微丸在时滞时间上与理论达到结肠部位的时间较为符合。结合以上参数，也可以判断制备得到的pH依赖-时滞型大黄素结肠定位微丸具有结肠定位释药特性。