柴苓术芍饮对肝郁脾虚型非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织氧化应激及炎症因子的影响

冯丽辉，万雪峰，郑忠蕊，韩海瑞，范明明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是肝功能酶学异常和慢性肝病最常见的原因，其危险因素包括高脂肪高热量的膳食结构、多坐少动的生活方式、胰岛素抵抗、代谢综合证如肥胖、高血压、血脂紊乱和2型糖尿病等。NAFLD的发病机制非常复杂,至今仍未完全阐明[1]。《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见(2017)》[2]中将此病分为5型，其中证型分布以肝郁脾虚证最为常见[3]。有研究表明脂质沉积[4]、氧化应激[5]、炎症因子释放[6]均可导致肝硬化和肝损伤，也是NAFLD的重要病理发展过程。故本研究从氧化应激及炎症因子的角度，探讨柴苓术芍饮对肝郁脾虚型NAFLD的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠35只，体质量(200±20)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号为SCXK(辽)2015-0001。于中科赛恩斯生物技术公司动物实验室饲养，使用许可证编号为SYXK(黑)2016-008。饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%；每天更换垫料，提供充足的水和基础饲料(中粮出品)。

1.2 高脂高胆固醇饲料 钴-60辐照灭菌，其脂肪供能比37%、蔗糖20%、猪油15%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%，购自广东省医学实验动物中心。

1.3 药物 柴苓术芍饮购自黑龙江省中医医院南岗分院，其主要成分为柴胡、当归、芍药、白术、茯苓、炙甘草、煨生姜、薄荷，泽兰、决明子、丹参、山楂、垂盆草、五味子，由黑龙江省中医医院南岗分院制剂室进行煎制，生药浓度为6.58 g/mL。

1.4 主要试剂及仪器 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒：美康生物科技股份有限公司；丙二醛(MDA)试剂盒：南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)试剂盒：武汉默沙克生物科技有限公司；GAPDH试剂：Abcam公司；羊抗兔IgG抗体：Millipore公司；TNF-α(WB法)和IL-1β(WB法)：ABclonal公司；飞克特超敏ECL发光液：Meilunbio。酶标仪：深圳雷杜RT2100C；全自动生化分析仪：日立LST008AS；5200全自动化学发光图像分析系统：Tanon；EPS600电泳仪：Tanon。

2 方法

2.1 实验动物分组、模型制备及给药 将35只SD大鼠随机分为5组：正常组，模型组，柴苓术芍饮高、中、低剂量组，每组7只。所有大鼠适应性喂养1 周后，除正常组外，模型组及柴苓术芍饮高、中、低剂量组用高脂高胆固醇饲料+饥饱失常法+夹尾刺激法[7]复制肝郁脾虚型NAFLD大鼠模型。夹尾刺激法为每天每只大鼠夹尾1次，时间为30 min；饥饱失常法为单日给予大鼠充足食物及水，双日禁食不禁水，喂养8周。按照《中药药理实验方法学》中人与大鼠按体表面积转换系数0. 018(大鼠等效剂量相当于人的6.3倍)计算给药剂量，柴苓术芍饮高、中、低剂量分别予25.2 g/kg、18.90 g/kg、12.6 g/kg剂量予大鼠灌胃给药，每天1次，连续灌胃4 周。正常组大鼠灌胃给予同体积生理盐水。用药期间，各组大鼠继续给予原有饲料喂养。

2.2 观察指标及检测

末次给药后大鼠隔夜禁食，乌拉坦药物麻醉后，取大鼠肝脏。准确称取肝组织200 mg，按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例，加入9倍体积的PBS，冰水浴条件下机械匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清备用。

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 其含量由全自动生化分析仪检测。

2.2.2 丙二醛(MDA)、肝组织肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量检测 采用酶联免疫吸附法进行检测。

2.2.3 肿瘤坏死因子(TNF-α)及白介素-1β(IL-1β)蛋白表达 采用Western Blot法进行检测。取20 mg肝组织，加入适量Complete RIPA buffer，冰上静置20 min，加入RIPA预冷浸泡小钢珠，冰冻研磨机震荡1 min；冰上静置30 min，涡旋震荡20 s；4℃时13000 r/min离心10 min，取上清-80 ℃保存。取40 μg蛋白的溶液，经上样、电泳、转膜、封闭、结合一抗、洗膜、结合二抗后，将膜浸于ECL发光液中，避光显色2 min，置于全自动化学发光图像分析系统扫描分析结果。

3 结果

3.1 各组大鼠肝组织SOD活性、MDA含量及TNF-α、IL-1β水平比较 见表1。

表1 各组大鼠肝组织MDA、SOD、TNF-α、IL-1β比较

3.2 各组大鼠肝组织IL-1β、TNF-α蛋白表达Western blot检测结果 见图1及表2。与正常组相比，模型组肝组织IL-1β、TNF-α表达升高(P<0.01)；高、中剂量组IL-1β表达量下降(P<0.05)，且高剂量组下降最明显(P<0.01)；高剂量组TNF-α表达量下降明显(P<0.01)。

注：A.正常组；B.模型组；C.高剂量组；D.中剂量组；E.低剂量组；

表2 各组大鼠肝组织IL-1β、TNF-α蛋白表达的比较

4 讨论

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种复杂的、系统性的代谢疾病，有研究表明亚洲地区NAFLD的患病率达27.37%[8]，且随着生活水平的提高，儿童NAFLD的整体患病率已接近10%[9]。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是包括肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝硬化在内的一系列代谢相关的肝脏病理综合征[10]，除了脂肪变性，肝组织会出现炎症浸润、肝细胞气球样变性，甚至伴有纤维化。研究表明，炎症小体的激活在单纯肝脂肪变性进展为NASH的过程中发挥关键作用[11]，炎症小体的激活不仅促进免疫细胞的大量浸润，还可引发一种新的促炎性细胞死亡形式-细胞焦亡[12]。因此，肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-1β)等炎症因子的检测可用来判断肝脏的损伤及其炎症反应程度。肝脏脂肪变性时，胆固醇(TC)及三酰甘油(TG)会有一定量的沉积，已有研究证明，SOD、MDA 与 TC、TG的沉积量有密切的关系[13]。SOD 是体内一种重要的自由基清除剂，可以避免超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应。脂质过氧化终产物 MDA 可形成蛋白加合物，刺激机体产生抗体介导的免疫损伤。临床上常通过抑制脂质过氧化反应和减少细胞变性，进而保护肝组织，治疗非酒精性脂肪性肝病[14]。

至今，由于其治疗靶点不够精确，NAFLD的治疗仍缺乏有效药物。中医药治疗NAFLD因有着显著的疗效和较低的副作用备受关注[15]。2017年，《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见》中指出，肝郁脾虚型NAFLD的主方为逍遥散。逍遥散来自宋代《太平惠民和剂局方》，具有健脾、化湿、养血之功效。柴苓术芍饮是在逍遥散主方的基础上增加了泽兰、决明子、丹参、山楂、垂盆草、五味子；全方共奏健脾疏肝解郁之效。

本实验模型组大鼠高脂高胆固醇饮食+饥饱失常造成脾胃损伤，夹尾令其活动受限，造成情绪抑制、情志不遂而致肝郁，模拟了肝郁脾虚证的发病过程。实验发现用高剂量柴苓术芍饮灌胃治疗后，大鼠肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MDA水平降低，而SOD活性增高，证明肝郁脾虚型NAFLD大鼠肝脏组织的氧化应激损伤减轻，相关炎症因子的表达降低，说明柴苓术芍饮对NAFLD大鼠的肝脏具有保护作用。通过对肝脏组织中炎症因子IL-1β、TNF-α的蛋白表达量对比分析可以看出，模型组肝郁脾虚型NAFLD大鼠肝组织中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达高于正常组，说明模型组炎症因子释放增加；而与模型组相比，各给药组中的IL-1β、TNF-α的表达量有所降低，其中高剂量组差异最显著(P<0.01)，提示柴苓术芍饮可能通过抑制炎症因子释放而达到治疗作用，从而实现对肝郁脾虚型NAFLD大鼠的干预。

综上，柴苓术芍饮可以下调肝郁脾虚型NAFLD大鼠体内IL-1β、TNF-α炎症因子的表达，降低MDA水平，提高SOD的活性水平，为临床上使用柴苓术芍饮治疗肝郁脾虚型NAFLD提供实验室依据。