响应面法优化ε-聚赖氨酸产生菌的发酵培养基

马鑫，张子桐，孟鑫岩，王野男，尤丽新*

(1.吉林农业大学 食品科学与工程学院，长春 130118；2.长春科技学院 生命科学学院，长春 130600)

微生物源天然防腐剂有着来源广泛、价格偏低等优势[1],天然防腐剂除了微生物源，还有植物源[2-3]，常见的有如下几种：乳酸链球菌素、纳他霉素、ε-聚赖氨酸[4]。其中ε-聚赖氨酸的最适pH值相较于其他两种防腐剂更为宽泛，且ε-聚赖氨酸的抑菌谱均比其他两种抑菌谱广[5]。ε-聚赖氨酸是由多个氨基酸残基(25～30个)构成的同型单体聚合物，化学法合成的为α型，具有一定的毒性，生物法合成的为ε型，有研究证明后者的抑菌活性比前者更强[6]。

ε-聚赖氨酸是40多年前日本学者Shima S和Sakai H[7]从放线菌发酵液中提取出来的，目前有许多学者对白色链霉菌进行诱变，其产量有所提高[8]。另有一些研究者不仅诱变选育了菌株，而且优化其发酵过程，产量均有所提高，但仍然有一定的进步空间[9]。

20世纪80年代，美、日、韩等国已经允许ε-聚赖氨酸在食品中用作防腐剂。2014年，其作为食品防腐剂也正式进入我国市场[10]。ε-聚赖氨酸目前在食品领域用作防腐剂，涵盖许多食品行业。比如用在延缓水产品品质劣变[11]、蔬菜保鲜[12]、延长肉及肉制品的保质期[13]、食品抑菌膜的制作[14]、某些农产品病害的预防[15]等方面。

为了提高ε-聚赖氨酸产量，同时获得更大的经济效益，本试验优化了突变菌株的培养基主要成分，获得的相关成果可为工业化生产提供一定的基础技术支持，以满足食品市场对此类天然保鲜剂的需求。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料及设备

1.1.1 菌种

本实验室所保存的经过诱变育种后的白色链霉菌。

1.1.2 试验材料

葡萄糖(分析纯)：天津市致远化学试剂有限公司；糖蜜(分析纯)：广西鑫财投资有限公司；玉米浆(分析纯)：南京茂捷微生物科技有限公司；氯化铵(分析纯)：天津市光复科技发展有限公司；ε-聚赖氨酸(化学纯)：郑州拜纳佛生物工程股份有限公司。

1.1.3 试验仪器

PB-10型酸度计 德国Sartorius公司；BSD-YX3200型立式双层智能精密型摇床 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AK/QC-058型离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-1800PC型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 培养基

液体种子液培养基(M3G培养基)：50 g葡萄糖，5 g酵母膏，10 g (NH4)2SO4，0.8 g磷酸氢二钾，1.36 g磷酸二氢钾，0.5 g MgSO4·7H2O，0.03 g FeSO4·7H2O，蒸馏水1 L，0.04 g ZnSO4·7H2O，pH(6.8±0.2)，灭菌条件为121 ℃，20 min[16]。

优化使用发酵培养基：碳源、氮源、无机盐成分与液体种子培养基相同。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液培养

在平板上选取长势较好的菌落取1环菌接种于液体发酵培养基中，培养24 h(条件为200 r/min，30 ℃)，以得种子液。

1.3.2 摇瓶发酵培养基的优化

将诱变后的菌株种子液按照10%接种量接入40 mL液体培养基(初始pH值为6.8)中，然后分别培养一定时间(条件为200 r/min，30 ℃)。

1.3.2.1 培养基中碳源、氮源的筛选

a.碳源种类的筛选

土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜使用浓度均为50 g/L[17]，其余营养成分：酵母浸粉5 g/L，无机盐与优化培养基相同，分别培养3，4，5，6，7 d，取发酵液测ε-聚赖氨酸含量以及菌体干重。

b.有机氮源种类的筛选

酵母粉、鱼粉蛋白、小麦蛋白、玉米浆、低温大豆饼粉、中温大豆饼粉使用浓度均为15 g/L[18]，其余营养成分：葡萄糖50 g/L，无机盐与优化培养基相同，分别培养3，4，5，6，7 d，取发酵液测ε-聚赖氨酸含量以及菌体干重。

c.无机氮源种类的筛选

硫酸铵、氯化铵和尿素使用浓度均为15 g/L[19]，其余营养成分：葡萄糖50 g/L，无机盐与优化培养基相同，分别培养3，4，5，6，7 d，取发酵液测ε-聚赖氨酸含量以及菌体干重。

1.3.2.2 培养基中碳源、氮源配比的筛选

根据碳源、有机氮源、无机氮源选择结果以及此菌株的生长曲线特性，以ε-聚赖氨酸增加量以及菌体干重增加量为指标，对碳源、氮源分别进行复配试验。

1.3.2.3 培养基中复合碳源、氮源筛选单因素试验

选择复合碳源含量分别为10～50 g/L之间的5个梯度，两种不同的碳源(比例为3∶2)，其余营养成分为玉米浆5 g/L，氯化铵10 g/L，无机盐与优化培养基相同，在上述相同条件下培养5 d，分别取发酵液测ε-聚赖氨酸增加量、菌体干重增加量以及pH的变化。

选择不同的碳源，配比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，碳源总量为30 g/L，其余营养成分为玉米浆5 g/L，氯化铵10 g/L，无机盐与优化培养基相同，在上述相同条件下培养5 d，分别取发酵液测ε-聚赖氨酸增加量、菌体干重增加量以及pH的变化。

选择总氮源含量分别为10～30 g/L之间的5个梯度，两种不同的有机氮源比例为1∶2，其余营养成分为葡萄糖50 g/L，无机盐与优化培养基相同，在上述相同条件下培养5 d，分别取发酵液测ε-聚赖氨酸增加量、菌体干重增加量以及pH的变化。

选择两种不同的氮源，配比分别为0.5∶2.5、1∶2、1.5∶1.5、2∶1、2.5∶0.5，氮源总量为15 g/L，其余营养成分为葡萄糖50 g/L，无机盐与优化培养基相同，在上述相同条件下培养5 d，分别取发酵液测ε-聚赖氨酸增加量、菌体干重增加量以及pH的变化。

1.3.2.4 培养基优化响应面试验

在单因素试验的基础上，以ε-聚赖氨酸含量为指标对复合碳源总量、碳源配比、复合氮源总量以及有机氮源和无机氮源配比进行响应面试验，优化培养基配方，响应面试验因素水平表见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.3 ε-聚赖氨酸含量的测定

参照Itzhaki[20]和Shima的方法。

2 结果与分析

2.1 碳源、氮源种类筛选结果

2.1.1 碳源种类筛选结果

选择5种常用物质作为碳源，分别为土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜，浓度均为5%，即50 g/L，产量结果见图1，菌体干重变化见图2。

图1 不同种类碳源对ε-聚赖氨酸浓度的影响Fig.1 The effect of different types of carbon sources on the concentration of ε-polylysine

图2 不同种类碳源对菌体干重的影响Fig.2 The effect of different types of carbon sources on the dry weight of bacteria

由图1可知，ε-聚赖氨酸浓度总体呈增长趋势，土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜5种碳源中以甘油和糖蜜为碳源的两个试验组ε-聚赖氨酸产量较高，分别为9.008，9.003 g/L。由图2可知，菌体干重也随着天数的增加呈上升趋势，发酵5～7 d增加不明显；发酵至第3天时，土豆淀粉作为碳源的试验组菌体干重较高，但其在后续发酵中并没有大幅度变化，可能是由于土豆淀粉不易溶于水，在测量中产生的误差。发酵至第5天时，当甘油作为碳源时，其试验组的菌体干重较高，为20.075 g/L，其次是糖蜜为碳源的两个试验组。由于葡萄糖有利于菌体早期的生长，因此碳源最终选择葡萄糖、甘油和糖蜜进行后续试验。

2.1.2 有机氮源种类筛选结果

本试验选择的有机氮源分别为酵母粉、鱼粉蛋白、小麦蛋白、玉米浆、低温大豆饼粉以及中温大豆饼粉，浓度均为1%，即10 g/L，配制发酵培养基；接种活化好的种子液后，分别发酵3～7 d，然后测定目标产物含量，结果见图3，菌体干重变化见图4。

图3 不同种类有机氮源对ε-聚赖氨酸浓度的影响Fig.3 The effect of different types of organic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

图4 不同种类有机氮源对菌体干重的影响Fig.4 The effect of different types of organic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

由图3可知，ε-聚赖氨酸的产量总体是上升的，玉米浆、低温大豆饼粉、中温大豆饼粉作为氮源的3个试验组ε-聚赖氨酸产量均较高，分别为8.097，8.039，9.002 g/L。但是，低温大豆饼粉作为氮源的试验组在发酵4 d后，产量并没有明显增加。由图4可知，除小麦蛋白试验组外，其他氮源试验组的菌体干重先增加后减少，其中以酵母菌作为氮源时，该试验组的菌体干重减少的最明显，中温大豆饼粉试验组减少的最不明显。小麦蛋白作为氮源时，该试验组的菌体干重一直处于上升的趋势，可能是小麦蛋白不利于微生物的前期生长。发酵至第5天时，小麦蛋白作为氮源其菌体干重较高，为16.763 g/L，其次是中温大豆饼粉、低温大豆饼粉、玉米浆、鱼粉蛋白(后三者相差不多)为氮源的4个试验组。这几种氮源在发酵5～7 d产物产量及菌体干重均并无大的变化；由于低温大豆饼粉试验组发酵4 d后ε-聚赖氨酸产量没有明显增加，小麦蛋白、鱼粉蛋白作为氮源的两个试验组ε-聚赖氨酸产量不高，因此选择玉米浆和中温大豆饼粉作为氮源进行后续试验。

2.1.3 无机氮源种类筛选结果

由图5可知，ε-聚赖氨酸的产量随着发酵天数的增加先增加而后出现了微弱的下降趋势，其中在发酵第5天时，氯化铵作为氮源的试验组其目标产物含量较高，为7.628 g/L。但是，硫酸铵作为氮源的试验组发酵4～7 d，目标产物并没有明显增加。由图6可知，菌体干重先增加而后出现了下降的趋势，其中硫酸铵作为无机氮源的试验组在发酵第5天其发酵液的菌体干重较其他两种无机氮源均高，为10.963 g/L。因此，选择硫酸铵和氯化铵作为无机氮源进行复配试验。

图5 不同种类无机氮源对ε-聚赖氨酸浓度的影响Fig.5 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

图6 不同种类无机氮源对菌体干重的影响Fig.6 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

2.2 培养基中复合碳源、复合氮源的筛选结果

根据上述营养物质种类的筛选，分别选出两种较为合适的营养物质，结合白色链霉菌的生长特性，对碳源、氮源进行复配，复配比例根据白色链霉菌典型的生长曲线设计。

2.2.1 碳源配比筛选结果

选择不同的碳源种类进行不同比例复配，以考察其对产物产量及菌体量的影响，结果见图7。

由图7可知，2号(葡萄糖∶糖蜜为3∶2)、3号(甘油∶糖蜜为2.5∶2.5)、4号(葡萄糖∶甘油∶糖蜜为3∶1∶1)3个复合碳源试验组的菌体增加量、ε-聚赖氨酸增加量均高于1号(葡萄糖∶甘油为3∶2)试验组，且2号、3号、4号3个试验组在菌体增加量、ε-聚赖氨酸增加量方面非常接近，所以从经济方面考虑，碳源选择葡萄糖和糖蜜进行复配，复配比例选择葡萄糖∶糖蜜为3∶2。

图7 碳源复配比例筛选结果图Fig.7 The screening results of compound ratios of carbon sources

2.2.2 氮源配比筛选结果

选择不同的氮源种类进行不同比例复配，以考察其对产物产量及菌体量的影响，结果见图8。

图8 氮源复配比例筛选结果图Fig.8 The screening results of compound ratios of nitrogen sources

由图8可知，2号复合氮源组(氯化铵∶玉米浆为2∶1)的菌体增加量以及ε-PL增加量较其他6组明显突出；1号(氯化铵∶大豆饼粉为2∶1)、3号(氯化铵∶大豆饼粉∶玉米浆为2∶0.5∶0.5)、7号(氯化铵∶硫酸铵∶大豆饼粉∶玉米浆为1∶1∶0.5∶0.5)3个复合氮源试验组的ε-PL增加量虽然也较高，但是1号、3号、7号这3组的菌体增加量并不明显。4号(硫酸铵∶大豆饼粉为2∶1)作为复合氮源时，菌体增加量以及ε-PL增加量均不明显；5号(硫酸铵∶玉米浆为2∶1)作为复合氮源时，菌体增加量以及ε-PL增加量亦均不明显；6号(硫酸铵∶大豆饼粉∶玉米浆为2∶0.5∶0.5)复合氮源组菌体增加量较为明显，但是其ε-PL增加量并不明显。根据上述分析发现，当大豆饼粉与其他氮源种类进行复配时，效果并不理想，可能是因为大豆饼粉会有一部分不能溶于水，从而导致其不能够完全利用，因此，氮源选择氯化铵和玉米浆进行复配，复配比例选择氯化铵∶玉米浆为2∶1。

2.3 复合碳源、复合氮源筛选试验结果

根据复合碳源、复合氮源的筛选结果，先对响应面试验中A、B、C、D 4个因素进行单因素试验，为响应面试验提供一个合理的数据范围后，再进行响应面试验得出最优组合。

2.3.1 复合碳源、复合氮源浓度单因素试验结果

2.3.1.1 复合碳源浓度单因素试验结果

将葡萄糖及糖蜜按照固定比例复配，考察其复配后不同的复合碳源总浓度对产物产量及菌体量的影响，结果见图9。

图9 复合碳源浓度单因素试验结果图Fig.9 Single-factor test results of compound carbon source concentration

由图9可知，菌体增加量一直呈上升趋势，但是ε-PL增加量则是先增加后减少，当复合碳源浓度达到30 g/L时，ε-PL增加量达到一个最高点(7.465±0.661)g/L，随后开始下降，在复合碳源浓度达到40 g/L以后下降趋势并不明显，pH值随着浓度的变化并无特别明显的变化，保持在4.0左右，因此可以看出浓度的变化对发酵液pH值的影响并不大。综上，单因素试验碳源浓度结果为30 g/L。

2.3.1.2 碳源配比单因素试验结果

将葡萄糖及糖蜜进行不同比例复配，保持一定的浓度，考察其复配后不同的配比对产物产量及菌体量的影响，结果见图10。

图10 碳源配比单因素试验结果图Fig.10 Single-factor test results of carbon source ratios

由图10可知，随着糖蜜量的增加、葡萄糖量的减少，菌体增加量先呈上升趋势再呈下降趋势，在碳源配比为1∶4时出现一个最高点，为(7.700±0.361)g/L；ε-PL增加量先出现了一个下降趋势随后开始增加，当碳源配比达到1∶4时，ε-PL增加量达到最高点，为(7.982±0.273)g/L，而后开始出现缓慢的下降趋势。pH值随着葡萄糖和糖蜜配比的变化，其变化不太明显，仍然保持在4.0左右。综上所述，碳源配比结果为葡萄糖∶糖蜜为1∶4。

2.3.1.3 复合氮源浓度单因素试验结果

将氯化铵及玉米浆按照固定比例复配，考察其复配后不同的复合氮源总浓度对产物产量及菌体量的影响，结果见图11。

图11 复合氮源浓度单因素试验结果图Fig.11 Single-factor test results of compound nitrogen source concentration

由图11可知，菌体增加量随着复合氮源浓度的增加一直呈上升趋势，但是ε-PL增加量则是先增加后减少，当浓度达到20 g/L时，ε-PL增加量最多，为(6.999±0.503)g/L。pH值有些许变化，呈上升趋势，即复合氮源浓度越高，pH值也随之增加。综上，复合氮源浓度单因素试验结果为20 g/L。

2.3.1.4 氮源配比单因素试验结果

将氯化铵及玉米浆进行不同比例复配，保持一定的浓度，考察其复配后不同的配比对产物产量及菌体量的影响，结果见图12。

图12 氮源配比单因素试验结果图Fig.12 Single-factor test results of nitrogen source ratios

由图12可知，随着玉米浆量的增加、氯化铵量的减少，菌体增加量先呈上升趋势再呈下降趋势，在氮源配比为1∶2时出现一个最高点，为(7.5±0.254)g/L；ε-PL增加量先是增加，亦是在氮源配比为1∶2时出现一个最高点，为(7.344±0.342)g/L。pH值随着玉米浆和氯化铵配比的变化，其变化先是保持在5.0左右，在氮源配比为1.5∶1.5时，pH值虽然开始下降，但仍然维持在4.0左右。结合经济、时间等各方面原因，氮源配比单因素试验结果为氯化铵∶玉米浆为1∶2。

2.3.2 复合碳源、复合氮源筛选响应面试验结果

结合单因素试验结果，以ε-PL含量为指标，以复合碳源浓度、碳源配比、复合氮源浓度以及氮源配比为因素，设计响应面试验见表1，响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface test results

上述试验数据拟合的各因素的回归方程为：Y=14.29+0.19A+0.15B-0.2C-0.053D+0.26AB-0.47AC+0.015AD-0.11BC+0.052BD-0.075CD-0.43A2-0.14B2-0.23C2-0.31D2。并对数据进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis table

续 表

由表3可知，模型的P<0.05，即此模型差异性显著，失拟项的P>0.05，即失拟项差异不显著，说明此模型拟合较好，能够反映出各因素与结果的关系，即模型可用。根据表3中F值的大小即可判断影响ε-PL含量的主次顺序为C(氮源浓度)>A(碳源浓度)>B(碳源配比)>D(氮源配比)。此试验中差异极显著的有交互项AC、二次项A2，达到显著的有一次项A、C和二次项D2。

2.3.3 响应面曲面图分析

A、B、C、D两两交互作用见图13～图18。通过对6个曲面的观察可以看出响应面与各因素之间的作用。

图13 碳源浓度与碳源配比对ε-PL含量的影响Fig.13 The effect of carbon source concentration and carbon >source ratios on ε-PL concentration

由图13可知，假设碳源配比保持不变，ε-聚赖氨酸含量变化随着碳源浓度的增加先上升后下降，说明碳源浓度过高对ε-聚赖氨酸含量不仅没有正方向作用反而还有反作用。当碳源浓度固定时，响应面陡峭程度较为平缓，随着碳源配比的变化其变化不大，即响应值(ε-聚赖氨酸含量)变化不大。说明A碳源浓度、B碳源配比两因素之间的交互作用不显著。

由图14可知，当氮源浓度固定不变时，ε-聚赖氨酸含量随着碳源浓度的增加，其变化先呈上升趋势后出现一小部分下降趋势。当碳源浓度固定不变时，ε-聚赖氨酸含量随着氮源浓度的增加，其变化先呈上升趋势后出现一部分平缓趋势，说明氮源浓度过高并没有积极作用。说明A碳源浓度、C氮源浓度的交互作用显著。

图14 碳源浓度与氮源浓度对ε-PL含量的影响Fig.14 The effect of carbon source concentration and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由图15可知，氮源配比固定不变，ε-聚赖氨酸含量随着碳源浓度的增加其变化先上升后下降。当碳源浓度不变时，响应面陡峭程度较为平缓，随着氮源配比的变化其变化不大，即响应值(ε-聚赖氨酸含量)的变化不大。说明A碳源浓度、D氮源配比的交互作用不显著。

图15 碳源浓度与氮源配比对ε-PL含量的影响Fig.15 The effect of carbon source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由图16可知，假设C固定不变，响应值随着碳源配比的变化其变化趋势平缓。当B不变时，随着氮源浓度不断增加，响应面陡峭程度较为平缓，响应值变化不大。说明B碳源配比、C氮源浓度的交互作用不显著。

图16 碳源配比与氮源浓度对ε-PL含量的影响Fig.16 The effect of carbon source ratios and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由图17可知，假设氮源配比固定不变，响应面变化随着碳源配比的增加其趋势平缓。当B不变时，随着D数值的变化，响应面陡峭程度较为平缓，响应值变化不大。说明B碳源配比、D氮源配比的交互作用不显著。

图17 碳源配比与氮源配比对ε-PL含量的影响Fig.17 The effect of carbon source ratios and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由图18可知，假设氮源配比不变，ε-聚赖氨酸含量随着C的增加，其变化先呈上升趋势后出现一小部分下降趋势。当C固定时，随着氮源配比的变化，响应面陡峭程度较为平缓。说明C氮源浓度、D氮源配比的交互作用不显著。

图18 氮源浓度与氮源配比对ε-PL含量的影响Fig.18 The effect of nitrogen source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

2.3.4 验证性试验

此软件得出最佳结果为：碳源配比为葡萄糖∶糖蜜为1∶4，复合碳源浓度为40 g/L，复合氮源浓度为15 g/L，氮源配比为氯化铵∶玉米浆为1∶2。经过3次平行试验，求取平均值，得出在此条件下其发酵液中ε-聚赖氨酸含量为14.76 g/L。

3 结论

碳源种类选择葡萄糖、甘油、糖蜜，有机氮源种类选择玉米浆和中温大豆饼粉，无机氮源种类选择硫酸铵和氯化铵。碳源配比为葡萄糖∶糖蜜为3∶2，氮源配比为氯化铵∶玉米浆为2∶1。

响应面试验优化的复合碳源、复合氮源结果为：复合碳源浓度为40 g/L，碳源配比为葡萄糖∶糖蜜为1∶4，复合氮源浓度为15 g/L，氮源配比为氯化铵∶玉米浆为1∶2。

发酵培养基配方为：葡萄糖8 g/L，糖蜜32 g/L，氯化铵5 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO4·7H2O 3.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.08 g/L，ZnSO4·7H2O 0.04 g/L，K2HPO42.4 g/L，KH2PO43.2 g/L，在此条件下其发酵液中ε-聚赖氨酸含量为14.76 g/L。