石油降解菌ZS1对典型抗生素毒害作用的应激响应机制

刘苏翔，高 宇，乔延路，薛建良

(山东科技大学安全与环境工程学院，山东 青岛 266590)

环境中抗生素的污染及生态效应是近年来环境领域的研究热点之一。对于大多数的抗生素来说，只有15%能够被吸收，其余的将通过尿液和粪便排泄到自然生态系统中，造成环境污染、危害生物健康[1-4]，全球诸多自然水环境持续检出抗生素的现状，引起社会各界广泛关注[5]。

本课题以近年来海洋环境抗生素污染为大背景，探究不同条件下，抗生素对海洋高效石油降解菌的抗氧化酶活性的影响。通过测定抗生素对降解菌的抑菌曲线及测定3种抗氧化酶SOD，POD，CAT的活性，考察抗生素对降解菌的毒性效应，为了解抗生素对环境污染高效降解菌的生态效应提供理论参考。

1 实 验

1.1 试验菌株

试验所用菌株为一株从海水中分离出的高效石油降解菌，该菌株通过16SrRNA测序测定为铜绿假单胞菌(ZS1)。海水取自中国山东省青岛市输油管道爆炸油污海域(36.07°N，120.38°E)。

1.2 主要试剂及培养基

3种抗生素(OTC，EM，SDZ)，购自上海麦克林生化科技有限公司。试验时，将3种抗生素分别用体积分数为0.1%的乙醇溶液(其对细菌CAT，POD，SOD活性测定的影响极微弱)逐级稀释至所需浓度。LB培养基：蛋白胨质量浓度10 g/L，酵母粉质量浓度5 g/L，NaCl质量浓度5 g/L，pH 7.4。

1.3 试验方法

(1)抗生素对ZS1的抑菌曲线的测定。将含ZS1的菌悬液在30 ℃、140 r/min下摇床培养24 h，使其处于对数生长期，将处于对数生长期的菌悬液用灭菌的LB培养基调整至所设计的浓度，加入配置好的抗生素溶液，使低浓度(μg/L级)抗生素系列终质量浓度为0.05，0.5，5，10，30，60，80 μg/L，高浓度(mg/L级)抗生素系列的终质量浓度为0.05，0.25，0.5，1，5，10，25，50 mg/L，同时设计溶剂对照组(含体积分数为0.1%乙醇的ZS1菌液)和空白对照组(含ZS1菌的LB培养基)，每组试验重复3次。

(2)CAT酶活性的测定。通过紫外比色法[18]测定CAT的活性。定义吸光度(A240)变化0.01为一个CAT活性单位，通过紫外-可见分光光度计测定其在240 nm下的吸光度，每隔1 min读数一次，共读数3次。

(3)POD酶活性的测定。通过愈创木酚法[19]测定POD的活性。定义吸光度(A470)变化0.01为一个POD活性单位，通过紫外-可见分光光度计测定其在470 nm波长下的吸光度，每隔1 min读数一次，共读数3次。

(4)SOD酶活性的测定。通过氯化硝基四氮唑蓝(NBT)法[20]测定SOD的活性。一个SOD活性单位定义为SOD抑制NBT光化学还原50%时的酶量，通过可见分光光度计于560 nm波长下测定吸光度，每组测定3个平行样。

2 结果与讨论

2.1 抗生素对ZS1的抑菌曲线

通过测量添加不同种类抗生素后ZS1的生长量，测定抗生素对ZS1的抑菌曲线。用抑菌曲线表示抗生素对ZS1生长量的抑制程度。不同浓度的OTC，EM，SDZ对ZS1的抑菌效果见图1。

由图1(a)和图1(b)可以看出：在不同的OTC浓度下，随着OTC浓度的增加，其对ZS1的抑制率明显上升，有显著的浓度-效应关系，但在OTC质量浓度低于0.5 μg/L时，ZS1的增殖能力不会受到明显抑制；较高浓度的OTC在长期作用时抑菌效果更好，而较低浓度条件下OTC在短期内能对ZS1表现出较好的抑菌效果。具体来看，在高浓度情况下，48 h的抑制率最大达98.8%，48 h的抑菌率高于24 h的抑菌率，可能是因为接触时间短，在此情况下OTC对ZS1活性的抑制来不及表现。在低浓度情况下，培养24 h时OTC对ZS1的抑制率高于培养48 h时，反映在较长时间的低浓度情况下，ZS1对OTC的抗药性随着培养天数的增加而增强。在实际环境中较低浓度的OTC在短期内能对ZS1表现出较好的抑菌效果，较高浓度的OTC则在长期作用时抑菌效果更好。整体来看，OTC浓度越大，其对ZS1的生长抑制作用越明显[21]。

由图1(c)和图1(d)可以看出，ZS1对EM的耐受性比对OTC的耐受性好，EM在高浓度下的抑菌率最大为27.18%。具体来看，随着EM浓度的增加，其对ZS1的生长抑制率均明显上升，但低浓度条件下，抑制率变化幅度较小。当EM质量浓度低于5 μg/L时，ZS1增殖能力不会受到明显抑制作用。研究表明，随着时间延长EM的药效会有一定程度的降低，在自然条件下EM的45 d降解率达到36.47%[22]。EM系列浓度作用48 h对ZS1的抑制率相对于作用24 h的数据同比降低，与ZS1对EM环境产生一定的适应性有关，且EM自身的缓慢降解也会影响药性[23]。

由图1(e)和图1(f)可以看出，SDZ对ZS1的生长抑制率随着浓度增加而增大，且由于ZS1对SDZ敏感性随着时间的延长而降低，故培养48 h对ZS1的抑制率比培养24 h下降。单独来看，高浓度条件下，SDZ对ZS1的最大抑制率达到16.47%。抑制效率随浓度升高有明显上升趋势，同比对ZS1的生长抑制作用较低。张从良等[24]研究发现，随着好氧降解进程的深入，经药物处理后细菌菌落总数增加较快，验证了SDZ对未灭菌湖水和猪场废水中细菌菌落总数增长具有一定的促进作用。

图1 3种抗生素对ZS1的抑菌效果培养时间，h：■—24； ■—48

综上所述，不同种类的抗生素对ZS1的抑制效果不同，但整体来看，均是抗生素浓度越高，其对ZS1的生长抑制效果越明显。

2.2 不同浓度抗生素的CAT酶活性

CAT是一类主要起催化底物氧化还原的酶，CAT能有效地清除各种活性氧基团，从而防止细胞膜系统的损坏[25]。通过紫外比色法对ZS1的CAT酶活性变化进行探讨，不同浓度的3种抗生素影响下的CAT酶活性如图2所示。

由图2可以看出，在分别加入3种抗生素后，CAT酶活性均呈现先上升后下降的趋势，表明在短时间接触抗生素刺激下，细胞体内遭受氧化应激时，可以通过CAT酶活性的增加来减少细胞的氧化损伤[26]。这与Kuznaik和Sklodowska[27]分析番茄感染灰霉病后导致SOD、CAT酶活性增加的结论一致，表明最初的感染诱导了它们的活性，从而激活了植物抗氧化的防御。当CAT酶活性显著低于对照组时，细胞内CAT酶的消耗与其产量之间不平衡，即活性氧积累过量，从而对细胞造成严重损伤。

从低浓度抗生素条件分析，如图2(b)、图2(d)和图2(f)所示，与未受抗生素污染时的酶活性相比，添加OTC后CAT活性相对较高，其原因是抗生素的加入会给微生物带来较大的氧化压力，使微生物的呼吸作用增强，产生大量的H2O2，从而通过增加微生物中CAT酶活性来解除H2O2的毒害作用。当CAT酶活性均高于对照组时，通过CAT酶产量的增加来减轻活性氧对细胞的损伤，从而起到保护细胞的作用。抗生素的种类以及污染时间也会对CAT酶活性产生一定的影响。

图2 3种抗生素影响下的CAT酶活性培养时间，h：■—24； ■—48

2.3 不同浓度抗生素的POD酶活性

POD是一种活性较高的氧化还原保护酶[28]。通过愈创木酚法对抗生素存在条件下ZS1的POD酶活性进行探讨，结果如图3所示。

由图3可以看出：添加OTC分别培养24 h和48 h时，POD酶活性均随OTC浓度的增大而下降，高浓度OTC对ZS1的抗氧化酶有较强的破坏性；随着OTC浓度的增加，细胞受胁迫程度加深，酶活性整体呈下降趋势。在OTC质量浓度为0.05～1.00 mg/L的范围内，48 h条件下酶活性较大，表明该浓度范围内的OTC对ZS1具有一定的氧化作用，但不足以影响微生物产生更多的POD来清除体内的过氧化物。然而，当OTC质量浓度大于1 mg/L后，OTC作用时间的延长会进一步导致ZS1细胞的破坏，酶活性整体呈下降趋势。添加EM培养48 h条件下，当EM质量浓度为0.5 mg/L时，POD酶的活性达到最高值。POD活性达到峰值时的浓度受抗生素种类所影响，POD对不同抗生素的耐受性不同。

图3 3种抗生素影响下的POD酶活性培养时间，h：■—24； ■—48

2.4 不同浓度抗生素的SOD酶活性

SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用[29]。采用NBT法对抗生素存在条件下ZS1的SOD酶活性进行探讨，结果如图4所示。

由图4可以看出，与培养初期(时间0 h)相比，添加高浓度OTC后，体系的SOD酶活性显著降低，表明抗生素的加入会产生较多的超氧化物，其氧化作用抑制微生物产生更多的SOD。低浓度OTC条件下，随着培养时间延长，48 h时SOD酶活性有一定的上升，表明添加OTC后随着培养时间的增长，ZS1对OTC产生了一定的适应性。

图4 3种抗生素影响下的SOD酶活性培养时间，h：■—24； ■—48

高浓度EM条件下，SOD酶活性先有微弱增长趋势，随后活性下降。当酶活性低于对照组时，由于活性氧积累过量而对细胞造成损伤。在添加低浓度EM条件下，培养48 h后的SOD酶活性变化幅度较大，其原因是一定浓度下EM引起活性氧的积累，造成细菌过氧化损伤，而SOD酶通过消除活性氧来保护细胞，表明抗氧化酶参与了细胞内的解毒机制[30]。添加SDZ条件下，SOD酶活性变化幅度较小，说明浓度梯度不会影响SDZ对SOD酶合成的正常作用，不会明显降低细菌的抗氧化、抗衰亡能力。

3 结 论

(1)抗生素浓度增加对ZS1生长的抑制作用明显增强，呈显著的浓度-效应关系。其中：培养24 h时OTC对ZS1的抑制效果弱于培养48 h时，可能是由于接触时间太短，OTC还未充分发挥作用；低浓度条件下培养48 h时EM对ZS1的抑制率低于培养24 h的抑制率，与EM自身药效随时间降低会有一定关系；ZS1对SDZ的敏感性随接触时间的增加而降低。

(2)在不同抗生素污染条件下，CAT酶活性均有先上升后下降的趋势，细胞遭受氧化应激时，均可以通过CAT酶活性的增加来减少细胞的氧化损伤。

(3)在抗生素污染条件下，随着抗生物浓度增加，细胞受影响程度加深，POD酶活性整体呈下降趋势；当抗生素质量浓度低于30 μg/L时，其对POD酶活性影响不大，说明在该浓度范围环境中虽产生了一定的氧化作用，但不足以影响微生物产生更多的POD来清除体内的过氧化物。

(4)在抗生素污染条件下，SOD活性变化幅度较大，主要原因是活性氧积累造成细菌过氧化损伤，细菌通过SOD酶消除活性氧进而保护细胞；当抗生素浓度低于30 μg/L时，不会影响SOD酶合成的正常机制，不会降低细菌的抗氧化、抗衰亡能力。