TRPV1在器官缺血/再灌注损伤中保护作用的研究进展*

张文翠， 项红兵

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉 430030

缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)损伤是指当已经失去血液供应的组织，其血液循环得到恢复后，活性氧和活性氮类被激活释放，一系列促炎基因转录激活，使得组织再次受到额外的损伤。I/R损伤常发生在中风、心肌梗死、心肺转流术及其他心血管手术中，同时也是循环性休克导致终末器官损伤的重要发病机制[1]。I/R损伤引起了一系列严重的临床问题，与多种疾病的高致残率和死亡率相关，然而到目前为止仍然缺乏有效的限制I/R损伤的治疗措施。瞬时受体电位(transient receptor potential，TRP)超家族由6个家族组成，按其主要氨基酸结构分类其被分成：TRPC、TRPVs、TRPMs、TRPML、TRPP和TRPA1[2]。TRP通道具有将外部环境的变化转化为膜兴奋性的能力，从而引起细胞内Ca2+浓度波动，吸引了大量的科学研究兴趣。其中瞬时受体电位香草酸亚型(transient receptor potential vanilloid，TRPV)又被分成6个亚型(TRPV1～6)，其中对TRPV1受体的研究最为广泛。TRPV1广泛分布在心脏、脑、肾脏、肺以及肠道等器官，在心血管系统、呼吸系统、中枢神经系统和消化系统等多种生理及病理生理过程中发挥重要作用[3]，可减轻多种脏器I/R损伤。

1 TRPV1概述

TRPV1是一种非选择性的离子通道，于1997年首次从背根神经节细胞中克隆出来，并作为哺乳动物的温度和伤害感受器，吸引了大量研究[4]。随着扫描低温电子显微镜技术的问世，至今已有50多个TRP家族通道结构得以被分辨清楚。TRPV1是同型四聚体，每个单体由6个跨膜结构域(TM1～6)和胞内N端、C端组成。其中TM5和TM6之间形成孔隙循环，而TM1～3为脂质区，通过与配体的亲脂部分结合，TM2和TM3启动受体构象改变，TM4的电压依赖性运动激活受体并打开离子通道，随后阳离子跨膜流动[5]。N端包括3个锚蛋白重复序列，C端包括瞬时受体电位通道结合位点[6]。TRPV1可以被低温(>43℃)、弱酸(pH<6.0)、内源性(N-花生四烯酸乙醇胺、N-花生四烯酰多巴胺、大麻素)和外源性配体(促炎脂质介质、动植物毒素、辣椒素)激活[7]。

2 TRPV1在I/R损伤中的作用

2.1 心脏保护作用

TRPV1在心室、心外膜表面、内皮细胞和血管平滑肌细胞上表达，也在支配心肌的感觉神经元上大量表达[8]。TRPV1在介导心肌I/R损伤后内脏传入纤维的激活中发挥重要作用，表达有TRPV1的传入神经是心肌缺血心源性交感兴奋性反射所必需的，TRPV1作为整合外周刺激的效应分子，可以检测到心肌缺血并激活心脏伤害性受体从而对心肌缺血产生心脏保护作用[9-10]。正常情况下，在缺血期间，心肌可以通过降低的pH、增加的血管紧张性、高水平的局部内皮素和内源性激动剂如大麻素激活TRPV1，许多研究表明激动TRPV1对心肌I/R损伤具有保护作用。研究报道N-油酰多巴胺(2×10-9mol/L，TRPV1激动剂)在Langendorff灌注心脏模型中增加了左心室发展压、冠脉血流和左心室压力最大上升/下降速率(dP/dt)，降低了左心室舒张末压，显著改善了心脏的I/R损伤，而在TRPV1基因敲除(TRPV1-/-)小鼠中该保护作用消失[11]。Wang等[12]研究将TRPV-/-小鼠和野生型小鼠的心脏在Langendorff装置中灌注，缺血40 min再灌注30 min，结果显示TRPV1-/-小鼠左室舒张末期压升高、左室发展压和冠脉流量降低，缺血后恢复灌注的损害较野生型小鼠更为严重。

2.1.1 TRPV1在糖尿病鼠中的心肌保护作用 临床资料显示糖尿病患者在心肌缺血后更易患上严重冠状动脉狭窄和发生心血管不良事件[13]，这可能正是因为糖尿病引起的感觉神经纤维损伤，导致TRPV1表达和功能下降，致使心脏感觉功能恶化，不能有效感应伤害性信息，最终使糖尿病患者更容易受到缺血性损伤。动物实验研究发现长期糖尿病会下调大鼠坐骨神经外膜小动脉中TRPV1的活性和表达，且糖尿病小鼠心脏TRPV1和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)均明显下降[14-15]。外源性补充CGRP(10-7mmol/L)能够减轻正常小鼠和糖尿病小鼠I/R损伤。然而，辣椒素预处理(10-6mol/L)，可以显著消除正常小鼠的心肌I/R损伤，而不影响糖尿病小鼠心脏[16]。这可能是由于糖尿病小鼠心肌TRPV1数量和功能下调，而外源性CGRP的存在使心脏保护作用恢复则表明下游分子CGRP参与了TRPV1介导的心脏保护作用。众所周知，神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在糖尿病神经病变和缺血性心脏病中起重要作用。最近Zheng等[16]研究发现，与正常小鼠相比，糖尿病小鼠心脏NGF、TRPV1及下游神经递质CGRP、P物质(substance P，SP)均表达降低，腺病毒介导的NGF过表达逆转了TRPV1和CGRP的减少，改善糖尿病心肌I/R损伤后的恢复，而SP水平没有改变。分别预先给予RP67580(10-6mol/L，SP受体拮抗剂)和CGRP8-37(10-6mol/L，CGRP拮抗剂)，发现RP67580不能调节NGF诱导的心肌保护作用，而CGRP8-37可消除NGF的心脏保护作用，且外源性补充低剂量辣椒素(10-6mol/L)能部分保留NGF的保护作用。这些实验结果表明NGF通过上调TRPV1受体，增加CGRP的合成和释放，从而改善心功能。

2.1.2 TRPV1参与了多种调节诱导的心肌保护作用 既往研究已证实缺氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)对大鼠心肌I/R损伤具有保护作用[17]，Lu等[18]研究探讨了TRPV1通道在介导缺氧预处理(10%氧气，4周)诱导的离体大鼠心脏保护作用，证实了辣椒碱(1 mmol/L，TRPV1拮抗剂)能减弱HPC产生的效应，表明TRPV1在HPC诱导的心脏保护效应中是其下游效应分子。花生四烯酸脂氧合酶(arachidonate 12-lipoxygenase，ALOX12)的代谢物是TRPV1的内源性配体，曾有学者提出ALOX12/TRPV1通路参与一种内源性损伤限制机制，保护心肌免受I/R损伤[19]。Lu等[18]进一步证实HPC诱导ALOX12及其代谢产物上调，激活TRPV1通道，增强PKC向肌细胞膜的转运，从而诱导心脏保护作用。

远端缺血预处理(remote ischemic preconditioning，RIPC)是一种有效的内源性I/R损伤的保护形式[20]。在致命缺血之前进行短暂的缺血和再灌注，可以减少梗死面积，促进器官功能恢复。Randhawa等[21-22]研究发现远端后肢连续4次5 min缺血再灌注预适应和辣椒素(10 mg/kg)预处理，可以显著降低心肌梗死面积、心肌酶释放，显著改善血流动力学。然而辣椒碱(2.5 mg/kg或5 mg/kg)和CGRP8-37(1 mg/kg)的存在显著降低了RIPC和辣椒素预处理诱导的心脏保护作用，表明RIPC通过激活TRPV1进而诱导CGRP释放，产生心脏保护作用。该学者还在另一项研究中提出RIPC通过激活TRPV1，抑制糖原合成酶激酶3β活性，进而增强缝隙连接耦合发挥心脏保护作用[23]。

手术切口创伤远端预处理(remote preconditioning of trauma，RPCT)作为远端预处理的一种形式，也是一种有效的心脏保护策略。Heymann等[24]研究在对大鼠进行冠状动脉闭塞30 min再灌注120 min之前，进行剖腹手术，结果发现与对照组相比，开腹手术组梗死面积减小；而当给予了辣椒碱(3 mg/kg)后，RPCT介导的保护作用显著降低，这说明RPCT同样也是通过激活TRPV1发挥心脏保护作用。

远端缺血后处理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)也是一种安全有效的心肌保护措施，可以防止I/R损伤。Gao等[25]发现CGRP8-37(2 mg/kg)和RP67580(5 mg/kg)预处理消除了RIPostC诱导的心脏保护效应。此外，TRPV1受体拮抗剂辣椒碱显著抑制了RIPostC诱导的血浆和心脏中CGRP和SP的增加，表明RIPostC通过TRPV1介导的CGRP和SP上调，减轻心肌I/R损伤。

近期研究首次证实口服降糖药物西格列汀对心肌I/R损伤的保护作用是通过靶向上调TRPV1/CGPR途径实现[26]。该研究口服喂养大鼠不同剂量的西格列汀(25、50、100、150 mg/kg·d)2周，然后分别分离心脏并构建I/R损伤模型，结果显示与对照组相比，西格列汀(50 mg/kg·d)组梗死面积和二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)活性显著降低，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性、内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，e-NOS)表达、TRPV1和CGRP水平显著升高。而L-NAME(25 mg/kg·d，NOS抑制剂)和辣椒碱(1 mg/kg·d)的使用减弱了西格列汀的心脏保护作用，表明西格列汀通过激活NOS系统和TRPV1促进DPP-4抑制介导的心脏保护作用。

2.2 脑保护作用

TRPV1在大脑的不同区域均有表达，包括海马体、皮层、中脑和小脑，并具有感受温度变化的能力。Cao等[27]证实TRPV1激活可诱导低温，对脑I/R损伤具有神经保护作用。该研究发现二氢辣椒素(1.25 mg/kg，TRPV1受体激动剂)可以诱导低温(33℃)，减少了87%的梗死面积，改善了中风小鼠的神经功能评分，然而在TRPV1-/-小鼠中该作用消失，提示TRPV1能诱导亚低温从而发挥神经保护作用。Huang等[28]在大鼠大脑中动脉闭塞(MACO)/再灌注模型中发现，在梗死周边区域注射辣椒素(1或3 nmol)可减少梗死灶体积，改善神经行为评分和运动协调能力。体外实验观察到辣椒素可减轻皮层神经元中谷氨酸诱导的兴奋性毒性损伤，减少谷氨酸刺激后的钙内流；辣椒素预处理后皮层神经元中NMDA受体GluN1和Glu2B亚基表达减少。敲除TRPV1基因可消除辣椒素对谷氨酸诱导的钙内流和随后的神经元死亡的抑制作用，表明辣椒素依赖于TRPV1下调NMDA受体的表达和功能从而发挥神经保护作用。越来越多证据表明自噬激活可以保护神经元免受缺血诱导的细胞死亡，有研究发现吴茱萸(Evodiamine，Evo)可诱导U87-MG星形胶质细胞自噬，TRPV1拮抗剂则抑制Evo诱发的自噬和细胞内钙升高，此外还降低了Evo诱导的氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的激活，提示Evo通过TPRV1诱导细胞外钙内流，随后导致JNK介导的保护性自噬，为缺血性中风治疗提供了新选择[29]。

2.3 肾脏保护作用

研究表明，表达TRPV1的感觉神经也分布于肾脏，并在生理和病理条件下调控肾脏功能。既往研究证实辣椒素和树脂毒素(TRPV1激动剂)预处理可减轻I/R诱导的急性肾损伤，其机制是TRPV1通道激活降低了包括TNF-α在内的促炎因子基因表达，并提高抗炎因子IL-10的表达来诱导肾保护作用[30]。Chen等[31]的研究通过测量小鼠血清肌酐、肾小管损伤评分和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)/Ly-6B.2阳性多形核炎症细胞丰富度，观察到辣椒素预处理(0.3 mg/kg)可明显改善以上指标，减轻I/R诱导的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，而辣椒碱预处理(50 mg/kg)并不改变I/R后肾脏的功能或组织学表现，表明激活TRPV1通道可以减轻I/R诱导的急性肾损伤，而抑制这些通道并不影响急性肾损伤结果。

随后Zhong等[32]研究通过西方饮食喂养TRPV1-/-小鼠和野生型小鼠22～23周，然后构建小鼠肾脏I/R损伤模型，发现与野生型小鼠相比，在TRPV1-/-小鼠中西方饮食诱导的糖耐量损害加重，皮质和髓质达到再灌注峰值所需时间延长，肾皮髓质血流量恢复率降低，肾功能受损更明显。此外，该研究进一步发现西方饮食减弱了野生型小鼠中I/R诱导的CGRP的释放，阻断CGRP受体加重了野生型小鼠肾损伤。这些结果表明TRPV1通过促进CGRP释放和增加肾血流进而在西方饮食诱导的肾脏I/R损伤加重中发挥保护作用。此外，近期的研究揭示肾脏I/R损伤后，高盐饮食可导致高血压和进一步的肾脏损伤，激活TRPV1在肾I/R损伤后预防肾组织损伤和盐性高血压中发挥了抗炎和抗氧化应激作用，而TRPV1表达阳性神经的退化可通过巨噬细胞介导的炎症加重盐性高血压和肾组织损伤[33-34]。

2.4 肺保护作用

TRPV1受体广泛表达于呼吸系统辣椒素敏感的感觉神经中枢和外周末端，调节呼吸功能。研究证实肺I/R损伤可以显著上调肺TRPV1、脑干CGRP受体和SP受体的转录和翻译[35]。其中CGRP可以诱导肺动脉血管扩张，同时SP可以介导气道平滑肌收缩、微血管血浆渗出和黏液分泌。而早期的一项研究提出TRPV1在肺I/R损伤中扮演重要角色。该研究通过阻断左肺门血供1 h再灌注3 h造成兔肺I/R损伤模型，发现辣椒素(50 mg/kg)预处理可显著改善肺气体交换功能，降低肺湿/干重比、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞浸润、肺丙二醛水平和髓过氧化物酶活性，增加超氧化物歧化酶活性和CGRP水平，减轻肺病理病变；然而辣椒碱(50 mg/kg)预处理可明显消除上述变化[36]。最近的一项研究认为TRPV1减轻肺I/R损伤部分依赖于α7nAChR活性，α7nAChR拮抗剂预处理消除了辣椒素对肺I/R损伤的保护作用，且α7nAChR刺激可缓解野生型小鼠和TRPV1-/-小鼠的肺损伤[37]，表明α7nAChR参与了TRPV1介导的对肺I/R的保护途径，具体机制尚待进一步研究。

2.5 肠保护作用

TRPV1主要存在于背根神经节神经元，小部分存在于结节神经节神经元，供应胃肠道的传入纤维和肠道神经系统的纤维和神经元[38]。辣椒素静脉注射或局部应用于胃肠道腔内和浆膜表面，可以引起迷走神经和脊髓传入纤维活动增加[39]，辣椒碱和钌红(TRPV1非选择性拮抗剂)抑制I/R后迷走神经传人纤维活性增强[40]，表明TRPV1受体在胃肠道传入纤维信号传递中的潜在作用。TRPV1还分布于胃黏膜层、黏膜下层和壁细胞层的神经末梢，对热、机械、化学和缺血刺激敏感，对维持胃肠黏膜损伤后正常功能起着重要作用。Du等[41]研究报道染料木素静脉给药可以减轻胃I/R损伤，其可能机制是TRPV1所介导的CGPR上调，进而达到胃保护作用。最新的一项研究发现铁死亡可加重肠道I/R损伤，肠道菌群代谢物辣椒素酯(capsiate，CAT)在体内和体外均能抑制铁死亡依赖的肠I/R损伤；然而该保护作用被谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，Gpx4)抑制剂所破坏；研究又进一步发现CAT促进Gpx4表达和抑制铁死亡依赖性肠I/R损伤能力被JNJ-17203212(TRPV1拮抗剂)所抑制[42]。因此，该研究提示肠道微生物代谢产物CAT通过激活肠I/R损伤中的TRPV1受体，提高Gpx4的表达，抑制铁死亡，为肠I/R损伤治疗提供潜在途径。

3 TRPV1通过多种信号级联机制参与I/R损伤过程

3.1 调控CGRP和SP释放

当TRPV1被各种刺激激活后能介导周围神经释放CGRP，CGRP通过强效的血管扩张作用，增加冠状动脉血流量，增强心脏功能。此前很早的一项研究显示，在离体大鼠心肌I/R损伤模型中，CGRP预处理显著改善心脏功能，减少再灌注室性心律失常的发生率，减少肌酸激酶释放，而CGRP8-37消除了这种保护作用[43]。Rang等[44]研究发现I/R前静脉注射吴茱萸，血浆CGRP含量显著增加，心肌梗死面积、血清肌酸酶和TNF-α水平显著降低，而辣椒碱预处理可完全消除吴茱萸的保护作用。SP与CGRP共定位于感觉神经末梢，已被证明在心肌缺血期间能从心脏传入纤维释放出来，以保护心脏免受I/R损伤，且SP的释放在辣椒碱的存在下显著减弱[12,45]。研究证实N-油酰多巴胺(TRPV1受体激动剂)可以促进野生型小鼠心脏SP和CGRP的释放，发挥心脏保护作用，但不增加TRPV1-/-小鼠心脏SP和CGRP含量，提示N-油酰多巴胺减轻心肌损伤机制是通过TRPV1介导SP和CGRP的上调[11]。

3.2 PKA/PKC信号通路

最近已经确定了TRPV1上的两个磷酸化位点，即Ser-502和Ser-800。Ser-502是多种酶的非选择性底物，包括蛋白激酶A(protein kinase，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase，PKC)和Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaM-dependent kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ)，而Ser-800对PKCδ诱导的磷酸化具有特异性反应[46]。PKC介导的磷酸化可以显著增加TRPV1介导的作用，如介导TRPV1对SP和CGRP的释放。研究表明PKC信号通路在I/R损伤中发挥重要作用，PKC拮抗剂消除了缺血预处理的保护作用[47]。Zhong等[11]研究发现在TRPV1受体激动剂给药前后灌流含有白屈菜赤碱(5×10-6mol/L，PKC拮抗剂)的灌流液5 min，激动剂的保护作用被阻断，提示PKC信号级联在TRPV1的心脏保护作用中发挥重要作用。研究进一步发现蛋白酶激活受体(protease-activated receptors，PARs)通过PKA/PKC信号通路激活TRPV1，促进SP和CGRP的释放，提供心脏保护作用[48]。用SLIGRL(10-7mol/L，PARs激动剂)预处理野生型小鼠和TRPV1基因敲除小鼠心脏，显著改善了I/R后的左心室舒张末压、冠脉血流和左心室压最大上升/下降速率(dP/dt)，然而这些效应在CGRP8-37(10-6mol/L)、R(10-7mol/L)、PKCδV1-2(10-4mol/L，PKCδ抑制剂)和H-89(5×10-6mol/L，PKA抑制剂)的存在下消失。此外SLIGRL预处理还可增强正常小鼠和TRPV1-/-小鼠心脏CGRP和SP释放。

3.3 CaMK/CREB/CGRP信号通路

Han等[49]探讨了芍药苷对糖尿病小鼠心肌缺血损伤的保护作用，研究发现与对照组相比，经芍药苷预处理的糖尿病小鼠心肌梗死面积减小，心肌酶释放减少，心功能恢复改善，TRPV1表达增加，血清CGRP释放增多；敲除TRPV1基因抑制了芍药苷介导的心脏保护作用；此外在联合给予了KN-93(CaMK特异性抑制剂)后，发现芍药苷对野生型糖尿病小鼠的保护作用减弱，而不改变TRPV1-/-小鼠的心功能；同时经芍药苷预处理后，cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)的磷酸化水平升高，且敲除TRPV1和KN-93基因抑制了该蛋白磷酸化。因此该研究证实了芍药苷至少部分通过TRPV1/CaMK/CREB/CGRP信号通路保护糖尿病小鼠心肌损伤。

3.4 PI3K/Akt信号通路

P13K/Akt信号通路具有抗细胞凋亡效应，已有许多研究指出它在I/R损伤中的重要作用。Jiang等[50]研究探讨了TRPV1的心脏保护作用是否与磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶(protein kinase B，Akt)和细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase，ERK1/2)信号通路抑制细胞凋亡相关。该研究分离出TRPV1-/-和野生型小鼠心脏，在Langendorff装置中缺血30 min后再灌注60 min，TRPV1-/-小鼠心肌梗死程度和心脏TUNEL阳性细胞百分比显著增加，Bcl2/Bax比值、Akt和ERK1/2磷酸化水平均显著降低;此外在I/R后，LY294002(PI3K抑制剂)处理显著增加了野生型小鼠心肌梗死面积和TUNEL阳性细胞百分比，降低Bcl2/Bax表达和Akt磷酸化，但在TRPV1-/-小鼠中无该效应，表明TRPV1通过PI3K/Akt信号通路在I/R过程中发挥抗心肌凋亡作用从而产生心脏保护效应。

4 总结与展望

综上所述，激活TRPV1能促进CGRP和SP的释放，激活一系列信号级联反应，在减轻心、脑、肾、肺、肠等各器官I/R损伤中发挥重要作用(图1)。同样TRPV1家族的其他成员如TRPV2、TRPV4也参与了I/R损伤调节。但是这些研究仅局限在基础研究层面，尚不能应用于临床，对于I/R损伤中TRPV1的激活、CGRP和SP的释放以及相关信号级联机制仍需进一步探讨，未来还需要进一步的体内和体外实验来严格评估TRPV1在器官I/R损伤中的作用，为药物研发提供靶点，为临床提供新的治疗策略。

图1 瞬时受体电位香草酸亚型1的结构及其减轻缺血再灌注损伤作用的信号级联反应Fig.1 Structure of transient receptor potential vanilloid 1 and the signaling cascade for alleviating ischemia/reperfusion injury