内质网应激关键分子ATF6α在癌症中作用的研究进展*

马炜祥， 张婷婷， 崔凤针， 盛 夏

华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所，武汉 430030

癌症是一类全球性疾病，其发病率和死亡率居高不下。中国作为最大的发展中国家，人口老龄化问题日益严重，正面临着癌症的严峻挑战[1]。2019年国家癌症中心发布：我国2015年新发恶性肿瘤病例约392.9万例，死亡病例约233.8万，死亡率为170.05/10万人[2]。癌症已经成为威胁中国人群健康的严重公共卫生问题之一，对国家、社会、家庭和个人都造成沉重的负担。

癌细胞基因组不稳定所导致的遗传多样性使得癌症具有细胞分化和增殖异常、细胞凋亡调控途径缺陷、DNA损伤修复机制缺陷等生物学特征。同时，癌细胞经常会改变细胞代谢(如有氧糖酵解和谷氨酰胺代谢等)并造成免疫逃逸。此外，肿瘤不单单是癌细胞组成的组织团块，而是由多种细胞类型组成的复杂组织，这创造了肿瘤微环境，从而有助于肿瘤的发展。这一系列的改变，使得肿瘤细胞面临外源性应激(缺氧、营养缺乏等)和内源性应激(如癌基因激活、抑癌基因抑制等)，这些压力都可能导致肿瘤细胞的内质网处于应激状态[3-4]。

1 内质网应激与未折叠蛋白反应

内质网(endoplasmic reticulum,ER)是细胞内加工合成蛋白质、储存Ca2+、进行脂质和碳水化合物代谢的主要场所。当细胞发生应激，如缺氧、营养缺乏、Ca2+稳态失衡等时，内质网功能发生紊乱，未折叠或错误折叠的蛋白在内质网腔中积聚，进而导致内质网功能障碍的病理状态，称为内质网应激[5]。为了缓解内质网应激，细胞会启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，并通过激活分子伴侣表达、调控脂质合成、促进内质网相关降解(ER associated degradation，ERAD)等方式减少未折叠或错误折叠的蛋白，恢复内质网稳态，提高细胞在不利条件下的生存能力[6-7]。UPR是内质网激活的一种细胞保护机制，由3个内质网跨膜感应蛋白——肌醇需求因子1α(inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)、类蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)和活化转录因子6(activating transcription factor 6α，ATF6α)所介导[7]。在无内质网应激时，IRE1α、PERK和ATF6α与分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)结合并处于静息状态；而当内质网应激发生时，GRP78主动与腔内聚集的未折叠或错误折叠蛋白结合，从而与这3种跨膜感应蛋白分离，IRE1α、PERK和ATF6α通路也随之激活(图1)。尽管PERK、IRE1α和ATF6α都是锚定在内质网膜上的感应蛋白，但ATF6α已被证实具有广泛的转录调节作用，其中包括ATF6α可以调控PERK下游蛋白CHOP以及IRE1α下游XBP1[8-9]。并且，近年来ATF6α在癌症发展方面的作用得到了广泛研究。鉴于此，本综述归纳了UPR，尤其是ATF6α在癌症中作用的研究进展，旨在为癌症治疗提供新的方向。

未折叠或错误折叠蛋白在内质网腔积聚，激活了3个内质网应激传感器(PERK，IRE1α，ATF6α)介导的UPR信号通路。这可以激活下游多个信号，促进分子伴侣表达、ERAD、氨基酸代谢、脂质合成、氧化还原、自噬等，重建内质网稳态。当内质网应激无法缓解时，UPR则会诱导细胞凋亡。图1 UPR的三条信号通路Fig.1 Three signal pathways of UPR

1.1 IRE1α

IRE1α具有蛋白激酶和核酸内切酶(RNase)双重活性。当GRP78与IRE1α解离后，IRE1α发生二聚化和自磷酸化，其RNase活性被激活后会特异性地剪切X盒结合蛋白(X-box binding protein-1，XBP1)mRNA上的一段26个核苷酸长度的内含子，进而翻译生成转录因子XBP1s(spliced XBP1)。该转录因子在内质网膜和分子伴侣的合成等方面具有重要作用，它可以上调多种折叠酶、氧化还原酶、糖基化酶的表达，并促进ERAD，以缓解内质网应激。除剪切XBP1 mRNA外，在某些条件下激活的RNase还可以迅速降解特定的mRNA，以降低蛋白折叠负荷，这一调控过程被称为受调控的IRE1α依赖性衰减(regulated IRE1α-dependent decay，RIDD)[10-11]。此外，当内质网应激不能得到缓解时，IRE1α还可通过其激酶激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路，从而介导细胞凋亡和细胞因子分泌[12]。

1.2 PERK

PERK二聚化和自磷酸化后会诱导真核起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)的磷酸化，从而使eIF2α失活，抑制mRNA的翻译，以减少大部分蛋白质的合成，缓解内质网折叠蛋白的压力。尽管eIF2α的磷酸化会导致整体翻译减弱，但同时某些特定基因的转录反而增加，比如转录激活子4(activating transcription factor 4，ATF4)。ATF4会进入细胞核并激活内质网应激反应基因，恢复氧化还原水平并推动氨基酸的生物合成和转运，促进细胞存活[13]。在慢性内质网应激持续存在的情况下，ATF4可激活凋亡蛋白C/ EBP同源蛋白基因(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)的转录，其通过抑制B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的转录、调节细胞氧化应激等途径介导细胞凋亡[14]。

1.3 ATF6

ATF6包括ATF6α和ATF6β两种同源蛋白[15-16]。与ATF6β相比，活化的ATF6α可以更加有效地激活内质网应激反应元件(ER stress response element，ERSE)，而ATF6β则充当转录阻遏物，主要起到抑制ATF6α介导的ERSE的激活作用[15]。ATF6α是Ⅱ型跨膜糖蛋白，由670个氨基酸组成，蛋白分子量约为90 kD[17]。在无内质网应激时，ATF6α与GRP78结合，掩盖定位信号。发生内质网应激时，二者解离，ATF6α被包装到COPⅡ有被囊泡，然后移位至高尔基体，在高尔基体中被位点1蛋白酶(site-1 protease，S1P)和位点2蛋白酶(site-2 protease，S2P)顺序切割，去除跨膜结构域与腔结构域，产生可溶性bZIP转录因子ATF6-N(50 kD)。随后，ATF6-N移位至细胞核并与UPR基因启动子上的ERSE结合[18]，激活GRP78、GRP94和CHOP等靶基因[9]。另有研究表明，ATF6α的剪切有助于IRE1α通路的激活：ATF6α和IRE1α可以分别调节XBP1的数量和质量，以完全激活UPR，缓解内质网应激[8]。

2 UPR在癌症中作用的研究概括

近年来关于UPR的研究非常热门，尤其是UPR在肿瘤中的作用受到了很高的关注。目前的大部分研究认为，UPR对肿瘤细胞起保护作用，能促进其存活从而有助于癌症的发展。例如，XBP1s可以调控缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducing factor-1α，HIF1α)途径，并通过与HIF1α形成转录复合物驱动三阴乳腺癌的发展[19]。IRE1α-XBP1s通路还可通过激活c-Myc信号通路的传导促进前列腺癌的发展，通过基因沉默或小分子化合物特异地抑制IRE1α和XBP1s的水平均能在小鼠模型中减缓前列腺癌细胞的生长[20-21]。PERK下游的ATF4及其靶基因FAM129A(family with sequence similarity 129 member A)，同样被发现可促进前列腺肿瘤的生长[22]。与原代乳腺癌细胞相比，PERK在进行上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)的乳腺癌细胞中表达更高，PERK的小分子抑制剂可以在体外有效削弱乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力[23]。另一PERK下游转录因子CREB3L1可以促进激活PERK信号的传导和上皮间质转化，从而促进乳腺癌细胞的侵袭和转移[24]。PERK也可以通过调节c-Myc信号介导肿瘤细胞的自噬和凋亡[25]。此外，PERK对肿瘤细胞的化疗耐药性也有一定影响。研究发现PERK对于人结肠癌的化疗耐药性至关重要，活化的PERK可以磷酸化核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)，进而上调多药耐药相关蛋白-1(multidrug resistance-associated protein-1，MRP-1)这一药物转运体，从而赋予人结肠癌细胞化疗耐药性，靶向PERK/Nrf2/MRP1信号通路可以消除人结肠癌对内质网应激和化疗的双重耐药性[26]。综上所述，UPR信号通路在肿瘤的生长和耐药性中起着重要作用，其信号通路中的一些信号分子也被认为是癌症治疗的潜在靶点[13]。

除IRE1α与PERK信号通路外，关于ATF6α信号通路在癌症中作用的研究也取得了一定的进展，概括如下：

2.1 ATF6α的表达水平与临床指标的关联

与正常组织相比，在很多肿瘤组织中都能够观察到ATF6α的表达增加。在结直肠癌患者中，ATF6α表达的增加与患者生存时间的减少和不良预后的发生存在明显正相关[27]。另有研究发现ATF6α基因上的一个错译单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)rs2070150可以明显提高ATF6α mRNA以及ATF6α调控基因(GRP78，XBP1和CHOP等)的水平，这可以更好地降解未折叠蛋白，从而使受试者对肝细胞癌易感性较低，并且有趣的是，尽管肝癌患者整体ATF6α表达水平比正常人低，但在肝癌组织中ATF6α的表达却高于非肿瘤组织[28]。因此，ATF6α对于肝癌进展的具体作用还需进一步探究。而且，与原发性肿瘤相比，ATF6α在非小细胞肺癌患者转移灶中表达更高[29]，提示ATF6α在癌症转移过程中可能发挥重要作用。这些证据表明ATF6α的表达水平与癌症发展密切相关。

2.2 ATF6α在癌细胞增殖和凋亡中的作用

正常细胞会控制生长促进信号的产生与释放，确保细胞周期的正常运行，保证细胞数目处于稳态；而癌细胞则可以不受生长信号的调节，持续维持增殖能力[4]。大量研究表明活化的ATF6α可以促进癌细胞增殖。Coleman等[27]研究发现肠上皮细胞中持续表达活化ATF6α的转基因小鼠，其上皮细胞增殖加快并可自发成瘤。ATF6α还可以上调蛋白磷酸酶2A的抑制性癌因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A)这一具有促增殖作用的蛋白，从而促进结直肠癌的进展[30]。与此同时，一些研究发现抑制ATF6α可相应减少癌细胞的增殖。奈非那韦(Nelfinavir)通过抑制S2P的活性减少ATF6α的活化，进而抑制脂肉瘤和前列腺癌细胞的增殖[30-32]。蛋白酶体抑制剂Oprozomib通过受控膜内蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)抑制S1P和S2P蛋白酶活性,减少ATF6α信号转导，从而降低人肝癌细胞的增殖能力与活性[33]。然而，尽管多数研究都提示ATF6α可以促进细胞增殖，也有少量关于ATF6α抑制增殖的研究报道。Spaan等[34]发现XBP1和ATF6α的表达激活会分别导致细胞周期在DNA合成前期(G1期)和DNA合成后期(G2期)停滞并激活PERK信号，减少大肠癌细胞的增殖和干性。也有研究提及ATF6的敲低可以增强乳腺癌细胞不依赖于c-Myc通路的克隆生长[35]。因此，ATF6α对于增殖的作用可能依赖于具体环境并具有肿瘤细胞类型特异性。

当出现严重或持续的内质网应激时，UPR信号会激活细胞凋亡[6-7]。ATF6α可以调控CHOP、JNK等介导的凋亡信号通路[36-38]。Gwak等[39]研究发现白藜芦醇(resveatrol)介导卵巢癌细胞的凋亡是通过破坏葡萄糖代谢，特异性地中断蛋白N-连接的糖基化，从而激活内质网应激传感器PERK和ATF6α。另一方面，也有研究报道了ATF6α在抗凋亡方面的作用。PERK通路对于内质网应激诱导的细胞凋亡起着重要作用，而IRE1α和ATF6α的持续激活可以抑制PERK通路诱导的凋亡[40]。因此，ATF6α在肿瘤细胞凋亡中的作用可能也因具体环境的差异而不同。

2.3 ATF6α与自噬

自噬具有降解错误折叠的蛋白、清除受损细胞器、调节细胞生长衰老以及抵抗病原体等功能，其与UPR密切相关，PERK、IRE1α、ATF6α等都被发现可以激活自噬[41]。Wang等[42]研究发现丙型肝炎病毒核心蛋白在内质网应激时可以激活PERK和ATF6α通路，进而诱导转录因子ATF4和DNA损伤诱导转录因子3(DNA-damage-inducible transcript 3，DDIT3)，ATF4上调自噬相关蛋白12(autophagy related 12 homolog，ATFG12)，DDIT3增加自噬基因微管相关蛋白1轻链3β(microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，MAP1LC3B/LC3B)的转录，从而诱导肝癌细胞自噬的发生。死亡相关蛋白激酶1(death associated protein kinase 1，DAPK1)是一种由γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)调控的蛋白，在调控自噬和癌症转移方面发挥重要作用[43]。IFN-γ可以诱导ATF6α蛋白水解，并和磷酸化的转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(CAAT-enhancer-binding protein-beta，C/EBP-β)起控制DAPK1的表达，进而调控自噬[43-44]。XBP1和ATF6α在日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)诱导自噬的过程中起到了关键作用，ATF6敲除会明显提高JEV的RNA水平与病毒滴度，并导致自噬缺陷，从而诱导小鼠神经母细胞瘤的细胞凋亡[45]。此外，ATF6α还可能直接激活自噬：在乳腺癌细胞中，酸性核糖体P蛋白(acidic ribosomal P proteins，RPLP proteins)的缺失会导致活性氧的积累从而通过激活UPR的ATF6α与eIF2α通路，以一种机制尚不明确的方式快速有效地激活自噬，这可以促进乳腺癌细胞的存活[46]。由此可见，ATF6α与自噬密切相关，共同影响癌症的发展。

2.4 ATF6α与细胞休眠

癌细胞休眠可能是癌症进展的一个阶段，在该阶段癌细胞细胞周期停滞，癌症长时间处于隐匿与无症状状态，并且癌细胞休眠与原发性肿瘤扩散到继发性器官以及肿瘤的复发有关[47]。作为癌细胞休眠的重要调控因子，P38可以调节休眠癌细胞中ATF6α的核移位和转录激活，ATF6α进一步上调脑Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，Rheb)并激活雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路来促进休眠鳞癌细胞的存活，而ATF6α敲除则可延长携带休眠癌细胞的小鼠的生存时间[48-49]。另外，休眠可能是导致肿瘤细胞治疗耐药性的重要原因之一。Higa等[50]发现蛋白质二硫键异构酶A5(protein disulfide isomerase A5，PDIA5)是ATF6α激活所必需的，并且PDIA5/ATF6α激活对于赋予癌细胞化学耐药性至关重要，间接表明了ATF6α与休眠之间可能存在关系。有趣的是，已有研究表明阻断Notch信号通路的转导可以防止休眠肿瘤细胞的复发[51]，而ATF6α的激活可以上调NOTCH1基因在胶质母细胞瘤中的表达，这表明靶向ATF6α通路可能提高放疗对该肿瘤的疗效[52]。总的来说，ATF6α在癌细胞休眠过程发挥着重要作用，但目前关于ATF6α与肿瘤细胞休眠的机制还相对不明朗，有待进一步的探究。

2.5 ATF6α与侵袭和转移

癌细胞向临近组织侵袭和远端组织转移是癌症的重要标志之一[53]。癌细胞向不同器官侵袭和转移，使得肿瘤易对常规治疗产生抵抗力，从而增加了癌症治疗的难度[54]。近年来，ATF6α通路在肿瘤细胞侵袭与转移中的作用逐渐被揭示。ATF6α可以通过激活GRP78上调尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator，uPA)的水平，上调的uPA进一步通过稳定突变P53促进胰腺癌细胞的侵袭与转移[55]。严重缺氧条件下，ATF6α通路可以诱导解聚素-金属蛋白酶17(A disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)的表达，已有研究证明ADAM17可以通过调控整合素β1(integrin β1)的信号传导促进肝癌细胞的侵袭和转移[56-57]。另外，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)的表达可以增强黑色素瘤细胞的侵袭与转移，ATF6α和PERK均可以诱导FGF的表达，也进一步提示ATF6α可能对肿瘤侵袭和转移具有促进作用[58]。

3 展望

肿瘤细胞的内质网在微环境和内在压力作用下常处于应激状态，因而启动UPR以解决内质网应激，恢复内质网稳态[3]。综上可知，ATF6α介导的信号通路作为UPR信号通路的关键分支，在参与癌症的进展，癌细胞的增殖、凋亡、自噬、休眠、侵袭和转移等方面都发挥了重要作用(图2)。ATF6α通过发挥广泛的转录调控作用，缓解肿瘤细胞内质网应激，进而支持肿瘤细胞存活，促进癌症发展。值得一提的是，目前已经研究发现Ceapins系列小分子化合物可以使ATF6α胞质结构域与ABCD3(ATP-binding cassette sub-family D member 3)跨膜区域相互作用，阻止ATF6α转运到高尔基体，从而特异性地抑制ATF6α信号转导[59-61]。然而，关于Ceapins在离体和在体肿瘤模型中的效能研究还未见任何报道。因此，鉴于ATF6α在肿瘤中已知的作用，有关ATF6α小分子抑制剂的应用将极具研究前景。未来，ATF6α在癌症发展作用中的机制还有待进一步挖掘，ATF6α小分子抑制剂在肿瘤模型中的效能研究还有待进一步探讨，这些研究结果将从转化医学的角度为ATF6α是否能够成为癌症治疗的新靶点提供科学依据。

活化的ATF6α(ATF6-N)入核后可以启动多种基因的转录，包括诱导转录因子DDIT3表达，进而增加自噬相关基因的转录，也可以与磷酸化的C/EBP-β一起调控DAPK1的表达，进而诱导自噬。ATF6-N还可以促进侵袭与转移相关基因的转录，激活mTOR信号，诱导CIP2A与XBP1s的表达，进而诱导c-Myc的表达，在肿瘤细胞生存和耐药性方面发挥作用。此外，ATF6-N也可以介导细胞的凋亡，并通过停滞细胞周期、激活PERK信号通路，以减少肿瘤细胞增殖。图2 ATF6α在癌症中作用的示意图Fig.2 Schematic diagram of the roles of ATF6α in cancer development