免疫性血小板减少症患者外周血Th17/Treg相关因子的表达及意义

仲晓玲，吴文静

(南京大学医学院附属鼓楼医院输血科，江苏 南京 210008)

免疫性血小板减少症(immunologic thrombocytopenic purpura，ITP)是一种自身免疫出血性疾病，以血小板计数减少为主要表现，并可伴随皮肤、黏膜甚至内脏出血[1-2]。近年来，随着现代社会生活压力的增大，免疫类疾病越来越高发，ITP的发病率也呈逐年上升趋势，严重威胁人们生命健康。ITP的发病机制尚未完全明确，免疫功能紊乱被认为在其中发挥着重要作用，最初的研究多集中于体液免疫方面，认为体液免疫异常是ITP的主要致病因素[3]。近年研究[4]发现，辅助性T细胞(helper T cell，Th)亚群的免疫异常与ITP发病具有关联性。辅助性T细胞17/调节性T细胞(helper T cell 17/regulatory cells，Th17/Treg)的免疫失衡参与了自身免疫性疾病的病理改变过程[5-6]。Th17细胞能够分泌致炎性细胞因子白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)，Treg细胞可分泌IL-10等重要效应细胞因子，二者在分化、功能上均相互拮抗，共同维持机体免疫状态的相对稳定。本研究旨在通过检测ITP患者外周血Th17、Treg比例及血清IL-17、IL-10水平变化，探讨Th17/Treg及相关因子失衡在ITP发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月至2021年6月在南京大学医学院附属鼓楼医院确诊的ITP患者60例(ITP组)，其中男性28例，女性32例；年龄18～71岁，平均(48.65±8.95)岁。纳入标准：(1)符合ITP诊断标准[7]，初次发病；(2)尚未接受过血小板输注；(3)未行脾切除治疗；(4)未服用对凝血功能有影响的药物。排除标准：(1)合并其他自身免疫性疾病者；(2)急慢性感染者；(3)恶性肿瘤患者；(4)有血液系统疾病史者。另选取60名同期健康体检者作为对照组，均排除自身免疫性疾病、血液系统疾病等，其中男性33例，女性27例；年龄20～65岁，平均(47.11±9.36)岁。两组性别构成、年龄对比，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院医学伦理委员会批准，入组对象均签署知情同意书。

1.2 Th17、Treg细胞的检测

入组对象均于次日清晨抽取空腹状态下静脉血3 mL，放置在含枸橼酸钠的抗凝管中，采用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)等体积稀释，应用人淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCS)，用RPMI 1640培养基调整细胞浓度至2×106/mL，然后接种到24孔板，37 ℃孵箱中培养4 h。参照试剂盒说明书步骤进行操作，配置完毕后等待上机检测。应用流式细胞仪对Th17、Treg细胞比例进行检测。

1.3 血清IL-17、IL-10的测定

采集研究对象血清，置于-70 ℃环境下保存，最后进行统一检测。采用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法进行IL-17、IL-10的检测，严格按试剂盒说明书进行具体步骤操作。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 ITP患者外周血Th17、Treg细胞比例及其比值变化

相比对照组，ITP患者外周血Th17细胞比例和Th17/Treg比值增高，Treg细胞比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ITP患者与对照组外周血Th17、Treg细胞比例及其比值比较

2.2 ITP患者血清及IL-17>、IL-10水平及其比值变化

相比对照组，ITP患者血清IL-17水平和IL-17/IL-10比值增高，IL-10水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 ITP患者血清及IL-17、IL-10水平及其比值变化

2.3 Th17/Treg细胞及相关因子与血小板计数的相关性分析

ITP患者血小板计数为(18.26±10.37)×109/L，与外周血Treg细胞比例、IL-10水平呈正相关(r=0.823、0.744)，而与外周血Th17细胞比例、IL-17呈负相关(r=-0.881、-0.743)。见图1。

3 讨论

ITP的发病是多种机制共同参与导致，但免疫功能紊乱是其核心发病机制，以T细胞为主的免疫功能紊乱在疾病发生发展中起着重要作用，机体免疫异常可致使机体抗血小板抗体与血小板发生结合，使得网状内皮细胞遭到破坏，从而造成血小板破坏增多，血小板数目减少[8]。既往研究[9-11]发现，ITP患者体内存在T细胞亚群失衡、相关细胞因子异常表达，其中细胞免疫功能失调是ITP发病的关键环节之一，如Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡失调等。

Th17细胞可与Th1细胞发挥协同作用，共同参与自身免疫性疾病的病理过程。Th17细胞与Treg细胞虽有着相同的分化过程，但两者功能相互拮抗，在正常情况下，二者处于平衡状态，Th17/Treg细胞的动态平衡有助于维持机体免疫状态的稳定，而Th17/Treg失衡是导致自身免疫性疾病发病的重要机制。Th17细胞、Treg细胞是由CD4+T淋巴细胞分化而成的两种细胞新亚群。当机体有炎症反应时，IL-6、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)共同诱导CD4+T淋巴细胞分化成为Th17细胞；机体不存在炎症反应时，TGF-β单独诱导CD4+T淋巴细胞分化为Treg细胞[12]。由Th17细胞所分泌的致炎细胞因子IL-17能够促进炎症因子表达，进而促进自身免疫性疾病的发生发展[13]。而Treg细胞分泌的抗炎因子IL-10则能够和细胞间直接接触而介导免疫抑制[14]。周正菊等[15]指出，ITP患者外周血Th17细胞比例显著增高。本研究也发现，ITP患者外周血Th17细胞比例和血清IL-17水平显著高于对照组，表明ITP患者存在Th17细胞和相关因子异常表达现象，这可能是ITP的重要病理机制之一。

本研究显示，ITP患者外周血Treg细胞比例和IL-10水平显著低于对照组，免疫抑制功能的减弱，与张萍等[16-17]报道一致。此外，本研究还指出研究报道，Th17/Treg细胞失衡所致的机体免疫异常，可能参与了ITP的病理机制，与Yazdanbakhsh等[18]研究与之一致。Th17细胞增多，Treg细胞减少，可使得机体免疫平衡遭到破坏，导致免疫失衡，从而诱发ITP[19-20]。本研究相关性分析显示，ITP患者血小板计数与外周血Treg细胞比例、IL-10水平呈正相关，而与外周血Th17细胞比例、IL-17呈负相关，提示ITP患者外周血Th17、Treg细胞比例和IL-17、IL-10水平可能能够反映病情严重程度。

综上所述，ITP患者存在Th17/Treg细胞失衡及相关因子异常表达，Th17/Treg失衡可能参与了ITP的发生发展。