聚类分析和主成分分析法对半枝莲指纹图谱的研究

胡婧文 赵颖

[摘要]目的研究不同产地半枝莲药材的 HPLC 指纹图谱，以此作为半枝莲的质量评价方法。方法利用 HPLC 法，建立13个共有峰的半枝莲指纹图谱，计算相似度。进行聚类分析和主成分分析，对结果进行比较，初步筛选出质量较好的批次药材。结果采用指纹图谱评价软件计算出15批药材相似度为0.930～0.992，聚类分析将15批药材分为五类，主成分分析法综合评价结果显示 s1、s6和 s11所在产地的药材质量最好。结论该方法简便、重复性较好，可用于半枝莲药材的质量控制。

[关键词]半枝莲; HPLC;指纹图谱;聚类分析;主成分分析

[中图分类号] R284.1  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2022）07-0061-05

Study on fingerprint spectra of scutellariabarbata by clustering analysis and principal component analysis

HU  Jingwen    ZHAO  Ying

Department of Pharmacy， Nanjing Hospital of Chinese Medicine， Jiangsu， Nanjing 210022， China

[Abstract] Objective To study the high-performance liquid chromatography （HPLC） fingerprint spectra of the medicinal herb of scutellariabarbata from different origins， so as to evaluate the quality of scutellariabarbata. Methods Fingerprint spectra of 13 common peaks were established for scutellariabarbata by using HPLC method， and their similarity was calculated. Clustering analysis and principal component analysis （PCA） were performed to compare the results and initially screen out the batches of medicinal herbs with better quality. Results The similarity of 15 batches of medicinal herbs （0.930-0.992） was calculated with fingerprint spectra evaluation software. Meanwhile， the 15 batches of medicinal herbs were divided into five categories by clustering analysis， and the medicinal herbs with the origins of s1， s6 and s11 were comprehensively evaluated as of best quality by PCA. Conclusion The above method is simple， reproducible and can be used for the quality control of the medicinal herb of scutellariabarbata.

[Key words] Scutellariabarbata; HPLC; Fingerprint spectra; Clustering analysis; Principal component analysis

半枝蓮为唇形科植物半枝莲（ScutellariabarbataD.Don）的干燥全草，具有清热解毒、消肿止痛之功效，用于治疗肝炎、咽喉肿痛等，外用治疗疔疮肿毒，毒蛇咬伤等[1]。现代药理学研究其具有治癌改善症状、破瘀止痛、解热护肝的作用[2-5]。半枝莲主产于江苏、浙江等地，主要成分为黄酮类以及二萜类化合物[6-7]，还有多糖类、绿原酸、熊果酸、肉桂酸等成分[8-9]

文献报道中对半枝莲化学成分及含量的研究颇多[10]，指纹图谱研究也有一些，但还未见通过相似度评价、聚类分析与主成分分析三者结合的方法评价不同产地半枝莲质量的文献。冯华等[11]研究团队通过生成 HPLC 指纹图谱并结合聚类和主成分分析来监测辣椒药用原料的质量;陈晓红等[12]研究组建立了覆盆子指纹图谱，并使用聚类和主成分分析选择优良的覆盆子品种，加强引种驯化，扩大种植规模，发展覆盆子产业;吴玲芳等[13]通过指纹图谱、聚类分析和主成分分析研究叶下珠的多酚部位。本研究采用高效液相色谱法结合“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件对半枝莲指纹图谱进行13个共同峰的相似度测定，使用 IBM SPSS Statistics 进行聚类和主成分分析，对三种方法的结果进行结合比较，初步筛选出产地质量较好的半枝莲药材。

1仪器与试药

1.1 仪器

waters 2695高效液相色谱仪（Waters Corporation， USA）、2998 DAD 检测仪（Waters Corporation， USA）、AK-1000A 高速粉碎机（上海硕光电子科技有限公司）、KQ-300DE 型数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）、MS205DU 十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO Group）。BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907

1.2 试剂

甲醇为色谱纯（江苏汉邦公司），磷酸为分析纯（南京化学试剂股份有限公司），水为怡宝纯净水（华润怡宝中国有限公司），对照品野黄芩苷（中国食品药品检定研究院），批号为 MUST-19051310，纯度为98.15%。

1.3  药材

15批半枝莲药材来源见表1。

2结果

2.1 试验条件确立及样品制备

2.1.1  HPLC 色谱条件Diamonsil C18（250×4.6 mm，5μm）色谱柱，流速：1.0 ml/min;柱温：25℃;检测波长：335 nm;进样量：10μl;流动相：乙腈和0.1%磷酸水溶液。梯度洗脱，0～5min，15%～20%乙腈;5～45 min，20%～22%乙腈;45～60 min，22%～25%乙腈;60～70 min，25%～30%乙腈;70～90 min，30%～70%乙腈;90～95 min，70%～15%乙腈。

2.1.2 对照品溶液的制备取对照品野黄芩苷，精密称取，用甲醇溶解稀释，制成野黄芩苷浓度101.7μg/ml 的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备取半枝莲粉末，精密称取2 g，精密量取甲醇60 ml，置于具塞锥形瓶中，称总重，超声30 min，冷却后再次称量，用甲醇补足到超声前总重，充分摇匀并过滤，取续滤液并通过0.45μm 微孔膜，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1  稳定性试验取同产地半枝莲样品，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，于0、4、6、12、18、24 h 依次进样测定（进样量10μl），记录13个共有峰的保留时间和峰面积，经计算，相对保留时间和峰面积的 RSD 均<3%，表明供试品溶液24 h 稳定性较好。

2.2.2 精密度试验取同一产地半枝莲样品，按“2.1.3”方法配制供试品溶液，连续进样6次（进样量10μl），结果相对保留时间和相对峰面积 RSD 均<3%，表明该仪器具有良好的准确度。

2.2.3 重复性试验取同一产地半枝莲样品，按“2.1.3”方法制备6份供试品溶液，进样并测定（进样量10μl），结果各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 均<3%，表明该测试方法的重现性良好。

2.3 指纹图谱的建立

将15批半枝莲样品的相应数据导入“中药色谱指纹图谱相似性评价系统2012版”软件。经分析后，确立13个共同峰，建立指纹图谱。其中2号峰峰面积较大，且分离度较好，因此将2号峰设为参照峰（野黄芩苷），结果见图1～2。在共有峰的相对保留时间上，15批次之间差异较小，说明药材的13种成分的出峰时间相对稳定;相对保留面积差异较大，说明不同产地半枝莲中相同的成分含量有较大差异。13个共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表2～3。

2.4 相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”分析15批样品数据，以样品 s1为参照图谱，选择中位数法、多点校正，自动匹配生成对照指纹图谱 R （见图3），建立了15批样品的指纹图谱，进行相似度评价，相似评价结果为0.989、0.976、0.930、0.943、0.981、0.987、0.986、0.961、0.986、0.975、0.990、0.958、0.992、0.971、0.987，在0.930～0.992之间。说明各产地药材有较好的相关性，差异性较小，此方法可用于评价半枝莲药材的整体质量[14]。

2.5 聚类分析

本试验采用 IBM SPSS Statistics 软件对数据进行聚类分析，将各共有峰的峰面积作为变量，采用组间联接法，以欧氏距离为测度，15批次半枝莲样品分析结果见图4，样品可聚为五类：s6、s11聚为一类， s4、s8、s13、s14、s15聚为一类， s2、s3、s7、s9、s10、s12 聚为一类，s1 和 s5 单独为一类。同类药材的相似度较高，差异较小。

2.6 主成分分析

将不同产地半枝莲药材的13个共有峰峰面积导入 IBM SPSS Statistics 软件，对数据进行主成分分析，计算特征值、累积贡献率、成分矩阵和综合得分。2.6.1 特征值、贡献率分析以特征值>1为提取标准[15]，确定了主成分1、2、3、4为半枝莲药材中13个共有峰的代表成分，4个主成分的累计贡献率为84.431%，因此可代表所有成分进行分析，用来评价半枝莲药材的整体质量。见表4。

2.6.2 成分矩阵根据系数大小可以判断，主成分1主要来自2、3、4、6、7、8、10色谱峰，主成分2主要来自1、5色谱峰，主成分3主要来自9、12、13色谱峰。4个主成分与各个变量之间的相关系数见表5。

2.6.3 主成分得分、綜合得分分析根据4个主成分计算主成分得分和综合得分，样品 s1、s6、s11为综合得分的前三名，说明这三批样品质量较好，主成分分析即筛选出具有代表性的共有成分进行计算评价。结果与相似度评价和聚类分析的结果一致。见表6。

3讨论

中药成分复杂，采用中药指纹图谱技术，能够将中药化学成分的种类与数量较全面地反映出来，从而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效[16-17]。在色谱指纹图谱分析中，无论是通过相关系数计算，还是通过矢量夹角余弦计算，都难以体现“量”的差异。即便图谱较为相似，确定为同一品种，但相似度不高。而结合化学模式识别的方法可做出进一步的评价[18-19]。

聚类分析和主成分分析常应用于各种样品的品质鉴定与分类研究。聚类分析可用于判断样品之间的相似性，将相似的样品归为一类，主成分分析通过从每批药材共有的化学成分中筛选出代表性和决定性的主成分，大致评价药材的质量[20-21]。本试验确立了 HPLC 色谱检测半枝莲的方法，简单易操作，准确性、重复性、稳定性均较好，可作为半枝莲质量检验方法的参考。相似度评价、聚类分析和主成分分析三者相辅相成，从图形和量上对药材指纹图谱进行分析更具有说服力。但是中药成分复杂，需要液相质谱联用及紫外、红外分析等更多的技术手段来评价各地药材的质量。本试验聚类分析中归为一类的样品在主成分分析中的排名也是靠近的，说明两种分析方法的结果较为一致。但是主成分分析排名结果主要由几种含量较多的成分来决定，前期进行15批药材中野黄芩苷含量的测定，野黄芩苷含量的多少与主成分分析排名结果一致。中药成分复杂，还有很多含量较少但有药理学作用的成分存在，所以不建议只采取一种分析方法，需要多种分析方法联合使用。BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907

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（收稿日期：2021-09-17）BBD11DA9-D321-468C-AF76-396C8FE1D907