应用液相色谱—串联质谱法对猪肉中3种β-受体激动剂残留检测与分析

曹忠君 盛常哲

摘要：本文建立了高效、准确的测定猪肉样品中β-受体激动剂残留量的高效液相色谱—串联质谱法。应用液相色谱—串联质谱法对来自市场中120批次猪肉样品进行3种β-受体激动剂残留的检测。结果显示，3种β-受体激动剂残留在猪肉中的平均回收率均为76.3%～94.5%。体现该方法具有准确、灵敏的特点，符合兽药残留分析检测的要求。

关键词：液相色谱—串联质谱法；β-受体激动剂；猪肉

β-受体激动剂是一类能够和肾上腺素β受体相结合、并能够激动受体产生分泌肾上腺素样作用的药物。常用的药物有克伦特罗、多巴酚丁胺、莱克多巴胺、沙美特罗、沙丁胺醇、福莫特罗等药物，这些药物通过作用β受体，从而有舒张支气管的作用，常用来治疗缓解慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等引起的支气管痉挛或收缩，缓解呼吸困难、胸闷气喘等病症。β-受体激动剂其化学性质不易变化。医学研究表明，β-受体激动剂吸收快，人食用了含其药物的内脏或肉，会造成群体性的恶性食物中毒事故。人食用后15～20分钟起作用，2～3小时血浆的浓度将达到峰值，体内存留时间较长。一般摄入20微克就可以出现心慌、呕吐、震颤等临床表现，中毒严重的可致人死亡。但近些年来，由于人们发现将其应用在畜牧生产中，提高瘦肉率，特别是改进脂肪型经济动物的肌肉与脂肪的比例（据有关报道可增加瘦肉率10%～20%）。因此，为降低饲养成本以达到谋取暴利的目的，国内一些牛、猪、羊饲养户在饲料中任意滥喂“瘦肉精”（β-受体激动剂），促使育肥的家畜提高瘦肉率。因此，β-受体激动剂常常残留在经济动物体内，从而影响人们身体健康。

目前测定食品中β-受体激动剂残留量的检测方法众多，而液相—色谱质谱法具有灵敏、准确等优点，是目前最有说服力的确证方法。本研究旨在验证液相—色谱质谱法检测猪肉中最常见的克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺3种β-受体激动剂残留的可行性。同时了解、调查了解某城市市场中猪肉中β-受体激动剂残留的实际现状，为农业和市场管理部门治理食品安全等现象提供参考。

1.1 仪器和设备

TQD型液相-串联质谱联用仪，配有电喷雾离子源；HY-4型调速振荡器；高速冷冻离心机；DKZ-3型恒温振荡水槽；ReekoMP-48型全自动固相萃取装置；MCX固相萃取柱（60毫克/3毫升）；CM-36型全自动水浴加热氮吹仪，连接纯度99.9%以上的高纯氮气；KQ-250DB型全自动数控超声波清洗器；CP225D型高精度电子分析天平（感量：0.00001克）；waters C18（2.1毫米×100毫米，1.7微米）超高效色谱柱；普兰德公司生产的移液器（10毫升、1000微升、250微升、50微升4种规格）。

1.2 试剂和材料

盐酸克伦特罗（Clenbuterol Hydrochloride，浓度值：98.0%，规格：100毫克/瓶）（坛墨质检-标准物质中心），硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate，浓度值：98.0%，规格：100毫克/瓶）（坛墨质检-标准物质中心），盐酸莱克多巴胺（Ractopamine hydrochloride，浓度值：95.4%，规格：100毫克/瓶）（坛墨质检-标准物质中心），分析纯乙酸铵、高氯酸（浓度：70%～72%）、叔丁基甲醚（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯），分析纯氢氧化钠，色谱纯乙腈，色谱级甲酸（浓度≥99%），β-盐酸葡萄糖醛苷酶（β-克lucuronidase，2毫升，Merck 克ermany），色谱纯甲醇，优级纯氢氧化钠，水为二次蒸馏水，50毫升聚乙烯离心管、0.2微米微孔滤膜（可应用于无机相）。120批次猪肉样品，分别于2018～2021年在多个市场随机抽取，样品编号为，PM/ SY001～PM/SY120。

1.3 方法

1.3.1 标准品及溶液配置 使用感量为0.00001克的天平精确称量克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺各0.01000克，用甲醇溶解定容至100毫升容量瓶中，使其浓度分别为，100微克/毫升的单一标准储备液，保存在-20℃的冰箱中，有效期为6个月。应用移液器分别准确吸取1000微升的克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺单一标准储备液至同一100毫升容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，使其浓度为1微克/毫升的混合标准储备液，保存在-20℃的冰箱中，有效期为6个月。

乙酸铵缓冲液（0.2摩尔/升）：称取15.4克乙酸铵，溶解于1升水中，用乙酸调pH至5.2即得。10摩尔/升氢氧化钠溶液：称取400.0克氢氧化钠加水溶解稀释至1000毫升即得。0.1摩尔/升高氯酸溶液：量取8.50毫升高氯酸加水溶解稀释至1000毫升即得。2%甲酸水溶液：准确量取2毫升甲酸加水定容至100毫升即得。3%氨水甲醇溶液：准确量取3毫升氨水应用甲醇定容至100毫升即得。甲醇0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）：分别准确量取10毫升甲醇和90毫升0.1%甲酸溶液混合均匀即得。

1.3.2 样品处理及提取应用绞肉机将约200克猪肉样品全部充分绞碎成肉泥状，精密量取两份2±0.05克平行肉样分别至50毫升聚乙烯离心管中，同法另取空白样品两份，其中一份为空白对照样品，另一份为添加3种β-受体激动剂的质控样品。每个离心管添加8.0毫升乙酸铵溶液（0.2摩尔/升），再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶40微升，混合均匀，于37℃下避光恒温水浴振荡16小时以上。

酶解后恢复至室温，充分涡旋混匀，10000转/分钟高速离心10分钟以上，倾出上清液导入至另一50毫升离心管内，加入0.1摩尔/升高氯酸溶液5毫升，充分涡旋混匀，用高氯酸调节pH至1.0，10000转/分钟以上高速离心10分钟后，将上清液移取至另一50毫升离心管中。用10摩尔/升氢氧化钠溶液调pH至9.5±0.2，加入15毫升乙酸乙酯，充分涡旋混匀后，再混合10分钟以上，10000转/分钟高速离心5分钟以上，移取上层有机相到另一个50毫升离心管中。再在下层水相中精准加入叔丁基甲醚10毫升，充分渦旋混匀后，再振荡10分钟，10000转/分钟高速离心5分钟，合并有机相，55℃氮气吹干，用甲酸水溶液（2%）5毫升充分溶解，备用。

1.3.3 净化 MCX固相萃取柱（60毫克/3毫升）按说明书活化，取所有备用液过柱，再淋洗，彻底抽干，用3.0毫升3%氨化甲醇溶液洗脱；洗脱液在55℃下用氮吹仪吹干。残余物用0.5毫升甲醇0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）溶解，充分混合混匀，过0.22微米水相微孔滤膜，供上机检测。

1.3.4 色谱条件 色谱柱：waters C18（1.7微米，2.1毫米×100毫米）色谱柱或相当者；流动相：A通道为0.1%甲酸水溶液，B通道使用100%乙腈溶液，梯度洗脫程序见表1；流速：0.40毫升/分钟；进样体积：5～10微升。

1.3.5 质谱条件 质谱条件不同型号仪器略有差别，应调试到最佳状态再进行检测，定量离子对、定性离子对和对应仪器条件参考值见表2。

2.1 计算公式

试样中β-受体激动剂含量X，单位为微克/公斤，按如下公式计算。

X=A×Cs/V/As/M/1000

式中：A—试样溶液中β-受体激动剂的峰面积；As—标准溶液中β-受体激动剂的峰面积；Cs—标准工作液β-受体激动剂的浓度（微克/毫升）；V—最终残留物洗脱液体积（毫升）；M—样品的重量（克）。

2.2 方法回收率

每次实验做1批次空白样及1批次质控样。

其回收率公式如下：

RC=质控样测定值/质控样添加值×100%

应用本方法β-受体激动剂在猪肉中的检出限为0.25微克/公斤，定量限为0.5微克/公斤，本研究共进行12次实验，每次实验10批次样品，空白添加三种β-受体激动剂浓度为：10.0纳克/克，其回收率均在76.3%～94.5%，说明其样品处理科学合理、净化效率高，待测组分损失小。

2.3 色谱图分析

由图1、图2可以看出沙丁胺醇、克伦特罗和莱克多巴胺分离完全，峰型良好，出峰时间合适，信噪比理想。说明该方法色谱柱效能高，色谱条件合适，流动相选择配比合理，能够很好的分离检测待测组分。

2.4 样品结果分析

从表3可以看出，100批次猪肉样品共有10批次检出有β-受体激动剂残留，检出率8.3%。其中克伦特罗被检测出6批次，检出率最高，使用最多，莱克多巴胺被检出1批次，检出率最低，使用最少，但均未达到定量限，说明待售动物都执行了休药期的规定，但存在滥用β-受体激动剂现象。我国农业部于2019年12月27日发布了第250号公告，其中，β-兴奋剂（β-a克onists）类及其盐、酯在清单之列，故针对“瘦肉精”问题进行严格监管势在必行。

作者简介：曹忠君（1979-），男，硕士，高级畜牧师。主要从事畜产品药物残留检验检测工作。