海参皂苷的制备及结构解析研究进展

钟静诗, 张 健, 王共明, 刘 芳, 刘 奎, 王艺欣, 刘海超, 赵云苹

海参皂苷的制备及结构解析研究进展

钟静诗1, 2, 张 健2, 王共明2, 刘 芳2, 刘 奎1, 2, 王艺欣1, 2, 刘海超1, 2, 赵云苹2

(1.上海海洋大学 食品学院, 上海 201306; 2. 山东省海洋资源与环境研究院, 山东 烟台 264006)

海参皂苷是海参体内的一种次生代谢产物, 主要用于抵御捕食者的侵害, 具有有效的抗肿瘤、抗帕金森病、免疫调节等作用, 应用前景广泛。提取制备海参皂苷是其他研究的基础, 而分析结构与活性的关系有助于深入理解其多种生物活性效应产生的原因。本文着重对目前海参皂苷的提取、分离纯化方法及结构分析进行了概述, 并对海参皂苷制备方法的优化和结构与生物活性之间的关系进行了分析展望, 以期能为相关研究提供参考。

海参皂苷; 提取分离; 皂苷结构

海参, 又称海黄瓜, 属棘皮动物, 体型呈椭圆柱状, 个体柔软。海参主要分为海参纲和刺身纲, 在我国沿海地区广泛存在。全球有超过1 716种海参的存在, 其中大部分分布在亚洲地区[1]。目前较多学者研究的海参品种主要有[2](刺参属)、[3](海参属)、[4](白尼参属)、[5](瓜参属)、[6](辐肛参属)和[7](梅花参属)。

皂苷是由糖基和配基组成的一类糖苷, 其苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物[8], 在植物如人参、桔梗、远志、甘草、柴胡中比较常见[9], 而在动物中发现较少。海洋生物皂苷主要存在于海参、海星等海洋生物体内[10]。海参具有与其他棘皮动物不同的特点, 它们能产生皂苷以抵御捕食者和寄生生物[11], 但目前尚不清楚海参产生皂苷具体的分子机制[12]。

目前, 对海参皂苷的研究主要集中在提取、分离纯化及活性研究方面。根据海参皂苷具有“亲水亲油”的特点, 通常采用溶剂提取法提取, 采用沉淀法和色谱法等手段进行分离纯化。在海参皂苷的生物活性方面, 相关学者研究发现海参皂苷具有抗肿瘤[13]、抗帕金森病[14]、进行免疫调节[15]等多种生物活性。但相较于海参其他生物活性物质, 海参皂苷的研究报道尚少, 且对于皂苷分子结构与其活性之间的构效关系研究相对缺乏。对海参皂苷的提取优化及分子结构的深入研究, 将有助于探明海参皂苷生物活性的分子基础, 并促进其活性的开发和应用。本文对海参皂苷的提取、分离纯化、结构及理化性质进行了综述, 以期为海参皂苷的进一步研究提供参考。

1 海参皂苷的提取

1.1 海参皂苷的提取来源

海参皂苷是海参的次生代谢产物, 在体壁、消化腺、生殖腺、呼吸树和居维氏管中都发现了皂苷的存在[16-19]。目前较多学者研究海参体壁、消化腺和居维氏管中的皂苷。袁文鹏等[19]从海参体壁、消化腺中提取海参皂苷进行营养成分的对比。Chumphoochai等[20]从海参体壁和居维氏管中提取海参皂苷并对其活性进行研究。研究表明海参体壁皂苷含量不及海参内脏中的皂苷[19], 但相较于海参体壁, 海参内脏皂苷的研究较少。

除了从海参中提取皂苷外, 海参烫漂后得到的废水也是皂苷的来源之一。海参用热水烫漂能使海参自溶酶失活, 阻止海参的自溶, 但这也导致了一些营养物质如蛋白质、氨基酸、碳水化合物、矿物质、皂苷的丧失。Yin等[21]发现利用热水处理海参会损失大量海参体壁中的皂苷, 损失量约41%。有研究报道称海参和海参烫漂液中都含有海参皂苷, 海参中皂苷含量约为0.81%, 而海参烫漂液中皂苷含量约为0.68%[22]。

1.2 海参皂苷的提取方法

皂苷通常可溶于水和醇溶液, 不溶于乙醚、氯仿和苯。根据皂苷性质对海参进行提取, 常见的提取方法为醇溶液提取和在此基础上改善使用大孔树脂进行提取。两种提取方法的流程如图1所示。

图1 常见海参皂苷提取方法流程图

醇提取法常用提取液有甲醇、乙醇、正丁醇等。除此之外, 有学者使用乙酸乙酯或多种溶剂按一定配比混合提取海参皂苷。目前, 提取海参皂苷使用较多的溶剂为乙醇, 而60%和70%乙醇体系最为常见, 推测与海参皂苷结构具有“两亲性”, 采用60%～70%乙醇相较于其他浓度乙醇提取海参皂苷的效率更高有关。

大孔吸附树脂法和醇提取法的区别在于大孔树脂法采用大孔吸附树脂代替了石油醚、乙醚和氯仿的萃取。相关研究认为, 大孔树脂提取法提取效率较高且能有效地去除混杂的盐类物质[23]。如表1所示, 在提取仿刺参属皂苷时, 利用大孔树脂法提取得总皂苷20.5 mg·g–1, 明显高于醇提取法的得率。另外, 对海参的预处理有利于提升海参皂苷的得率。有报道称在使用复合酶对海参进行酶解预处理后, 海参皂苷得率提升了一倍[24], 这为海参皂苷提取提供新思路。常见海参皂苷的提取方法具体见表1。

1.3 海参皂苷的含量测定

目前关于海参皂苷测定方法的研究尚少, 测定其他皂苷的常用方法有比色法、薄层色谱法和高效液相色谱法等。比色法具有简便、快捷的优点, 但其准确度会受到其他杂质的干扰; 薄层色谱法利用一定展开剂展开, 再联合运用其他仪器进行定量测定; 高效液相色谱法能有效的分离样品和杂质, 在皂苷的分离和测定中较常使用。薄层色谱法和高效液相色谱法都需标准品进行对照, 然而目前海参皂苷尚不具有高品质标准品, 对海参皂苷检测方法的选择造成一定的局限性。因此, 对海参粗皂苷进行含量测定时, 常采用比色法, 而对单个或几个单体皂苷的含量测定多使用后两种方法。比色法中使用的标准品除了海参皂苷单体外, 还可采用其他植物皂苷或齐墩果酸, 而高效液相色谱法则多采用分离纯化出的海参皂苷。不同方法测定海参皂苷含量通常可改变显色剂、色谱柱等以提高海参皂苷含量测定的准确性, 部分海参皂苷含量的测定方法详见表2。

海参皂苷不具有发色团, 采用紫外分光光度法无法直接对其进行含量测定。因此, 运用比色法对海参皂苷含量进行测定时, 需要通过溶剂与皂苷相互作用产生生色团从而在一定波长内检测出皂苷的含量。由表2知, 比色法常使用香草醛-高氯酸或香草酸-冰醋酸的显色体系显色。香草醛-酸显色体系的原理可能是海参皂苷在酸的作用下水解使C3位置上的羟基能与香草醛发生羟醛缩合反应而显色。杨志文等[37]在研究人参皂苷的定量分析中也持有相同的观点。

2 海参皂苷的分离纯化

通常提取后的海参皂苷为粗皂苷, 包含了多种单体皂苷。为了进一步研究海参皂苷活性及海参皂苷活性与海参单体皂苷之间的关系, 需对海参粗皂苷进行分离纯化。

海参皂苷多数为三萜皂苷, 少数为螺旋甾烷类皂苷。三萜类化合物分离的传统方法主要有分段沉淀法、胆甾醇沉淀法。分段沉淀法使用乙醚、丙醇或其混合物对不同极性海参皂苷进行分离; 胆甾醇沉淀法利用胆甾醇饱和的醇溶液和乙醚分离纯化海参皂苷。分段沉淀法和胆甾醇沉淀法的流程如图2所示。

表1 海参皂苷部分提取方法

注: —: 无对应项目。下同。

表2 部分海参皂苷含量测定方法

图2 海参皂甙分离纯化流程图

分段沉淀法和胆甾醇沉淀法的区别在于分段沉淀法是通过使用梯度溶剂逐步分离极性不同的皂苷。而胆甾醇沉淀法则是利用胆甾醇先与皂苷结合, 再通过去除胆甾醇得到纯化的海参皂苷。三萜皂苷通常不与甾醇形成稳定的复合物[38], 因此, 胆甾醇沉淀法还可用于三萜皂苷和甾体皂苷的分离。

色谱法是目前分离海参皂苷最常用的方法。用于海参皂苷分离的色谱法主要有大孔吸附色谱法、硅胶色谱法、高效液相色谱法和薄层层析色谱法等。以上方法主要根据皂苷的极性的不同对海参皂苷进行分离。其中大孔吸附色谱柱的方法主要是通过水洗和梯度的醇溶液的洗涤, 分离出糖及水溶性杂质和依次洗脱出极性不同的皂苷。吸附剂的不同决定了该种层析法不同的吸附特性[39]; 硅胶色谱法通常采用氯仿-甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱, 其特点是能分离分离度较大的化合物[40]。高效液相色谱法在分离纯化皂苷中最常见, 常用的色谱柱为ODS色谱柱, 洗脱剂为甲醇-水或甲醇。薄层色谱法分离纯化海参皂苷则常用甲醇-水或乙醇进行分离纯化。色谱柱、流动相和洗脱液的选择影响海参皂苷的分离纯化的效果, 部分海参皂苷分离纯化方法见表3。

表3 部分海参皂苷分离纯化方法

凝胶色谱法是根据分子量进行分离的一种层析方法, 海参皂苷分子量的大小主要取决于糖苷部分。凝胶色谱法在海参皂苷的分离纯化中应用的相关报道较少, 利用凝胶色谱法分子筛原理可分离具有不同分子量大小的海参皂苷。由表3可以看出, 为达到分离纯化的目的, 通常采用多种分离方法结合以得到较纯海参皂苷。

高速逆流色谱是近年来逐步发展的一项新技术,它与传统的色谱层析主要的不同点在于它是利用液-液萃取对提取物进行分离, 即用于分离的固定相和流动相都为液体。利用高效逆流色谱进行分离能避免固相对提取物的不可逆吸附, 并且它对样品的要求不高, 粗提物就可直接进行分离。目前已有研究报道高速逆流色谱法用于黄酮[47]、生物碱[48]、醌类[49]、香豆木脂素[50]等的分离纯化。近年来, 高速逆流色谱用于皂苷的分离纯化主要集中于柴胡[51]、薯蓣[52]、人参[53]等中药材, 用于海参皂苷的分离纯化较少。

3 海参皂苷的结构分析

海参皂苷具有几种特征性的理化性质, 据此可以判断提取纯化的化合物是否为皂苷。海参皂苷在水溶液中震荡能产生持久性的泡沫, 具有发泡性, 原因是海参皂苷是由亲水性的糖链和亲脂性的苷元组成的表面活性剂。皂苷鉴定最常用的显色反应为Libermann-Burchar反应, 又称醋酐浓硫酸反应。若在两层界面之间有紫红色反应, 则说明有苷类物质的存在。Molish反应也能判断提取物中是否含有苷类物质, 其判断依据是液面之间是否存在紫红色环[49]。

根据苷元部分的不同可将海参皂苷分为螺旋甾烷类皂苷和三萜类皂苷。截至2015年, 已经发现的海参皂苷的种类有700余种[44], 其中大多数为三萜皂苷。三萜类皂苷多数由30个C组成, 通常认为皂苷由六个异戊二烯单位聚合而成, 且多数为四环三萜或五环三萜。海参皂苷还可以分为海参烷型皂苷和非海参烷型皂苷, 它们的区别在于海参烷型皂苷含有18(20)-内酯环而非海参烷型皂苷含有18(16)-内酯环或不含有内酯环[54-56]。

组成海参皂苷糖基部分的单糖主要有D-葡萄糖(Glc), D-木糖(Xyl), D-奎诺糖(Qui), 3-O-甲基-D-葡萄糖(MeGlc)和3-O-甲基-D-木糖[55], 皂苷寡糖链通常由2-6个单糖组成[54]。

海参皂苷苷元母核结构式及糖链常见单糖结构式如图3所示。

图3 海参皂苷母核及其糖基部分常见单糖结构式

注: a. 海参烷性皂苷母核; b. 非海参烷型皂苷母核; c. D-葡萄糖; d. D-木糖; e. D-奎诺糖; f. 3-O-甲基-D-葡萄糖; g. 3-O-甲基-D-木糖

海参皂苷糖苷中单糖上是否含有硫酸基团以及硫酸基团所处的位置(如木糖C-4位、葡萄糖C-6位、奎诺糖C-3位)、海参皂苷配基及配基侧链中是否含有双键以及双键的数量和位置(如7(8)、9(11)、24(25)、25(26)、位上的双键)、苷元中羟基、环氧基、乙酰基(主要在配基的C-16、C-22、C-23和或C-25上[56])等的数量和类型[54]都使得海参皂苷具有多样性。

另外, Van Dyck等[57]研究发现海参皂苷之间能发生相互转化, 他们分析了在掠食者应激和未受干扰的条件下对皂苷的影响, 发现两种状态下皂苷的种类不同, 有的皂苷会发生转化形成另一种皂苷。这与Kamyab等[25]的观点一致。

常用的理化性质只能对海参皂苷是否存在进行简单判断, 通过现代仪器分析技术能进一步探究海参皂苷单体的结构。

海参皂苷是苷元为三萜类或螺旋甾烷类化合物的一种糖苷。采用傅里叶红外变换[45]、质谱[58]和核磁共振[59]等技术能解析海参皂苷的结构。红外光谱能通过分子振动产生的吸收频率判断化合物所含基团; 核磁共振能根据原子核的化学位移判断化合物的结构; 质谱能根据化合物的分子离子峰判断出化合物的相对分子质量, 再根据质荷比确定分子式, 最后通过离子峰确定化合物的结构。质谱在定性方面应用广泛, 通过联用气相色谱或液相色谱, 能同时对化合物进行定量分析。

4 展望

目前, 海参皂苷的研究尚处于起步阶段, 海参皂苷的提取分离仍缺乏统一且高效的方法, 建立海参皂苷制备的方法是研究海参皂苷的重要且基础性难题。大多数学者采用醇溶液提取海参皂苷, 化学试剂用量大, 对环境污染也较大。表面活性剂具有短时、低成本、优化有效成分、绿色环保等特点[60], 已应用于三七皂苷、薯蓣皂苷、人参皂苷等植物皂苷的提取研究中[61-63]。探究表面活性剂等友好型溶剂提取海参皂苷成为研究海参皂苷制备一个新方向。

另外, 海参皂苷的不同活性及活性强弱与海参皂苷的分子结构有关, 已有研究表明海参皂苷中硫酸基团、羰基对海参皂苷活性有影响[64]。因此, 单体皂苷的分离纯化及其结构解析、单体皂苷结构与活性之间的关系仍是当前海参皂苷研究重点和难点之一。下一步, 采用新型溶剂体系或表面活性剂提取海参皂苷, 利用超声、微波、酶解等现代科学新技术辅助提取, 优化海参皂苷的提取工艺; 采用多种方法相结合及应用高速逆流色谱法等新方法促进海参单体皂苷的分离纯化; 探究皂苷分子结构与活性的关系, 皂苷结构中的功能基团如含硫酸基团、含氧基团等对活性的影响等都是急需解决的研究内容。

近年来, 随着国内外学者对海参皂苷的深入研究, 其多种生物活性如抗肿瘤、抗帕金森和免疫调节等逐渐被人们认知。继续研究海参皂苷丰富的生物学活性, 明确各种活性的分子生物学机制, 对针对性的开发相关功能性产品, 高值化开发利用皂苷, 对保障人类健康, 提升人们的生活质量都具有重要作用。

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Research progress in the preparation and structural analysis of sea cucumber saponins

ZHONG Jing-shi1, 2, ZHANG Jian2, WANG Gong-ming2, LIU Fang2, LIU Kui1, 2, WANG Yi-xin1, 2, LIU Hai-chao1, 2, ZHAO Yun-ping2

(1. College of Food Sciences & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China)

Sea cucumber saponins, which are mainly used for defense against predators, are secondary metabolites with anti-tumor, anti-Parkinson’s disease, and immune-regulating bioactivities. These also have broad potential applications. The extraction and preparation of sea cucumber saponins are the basis of other studies, and the analysis of the relationship between their structures and activities is helpful for an in–depth understanding of their multiple biological activity effects. In this study, the extraction, separation, purification, and structural analysis of sea cucumber saponins are summarized. Furthermore, the optimization of the preparation of sea cucumber saponins and the relationship between their structures and biological activities are prospected to provide a reference for related research.

sea cucumber saponins; extraction and separation; structure of saponins

Sep. 12, 2020

TS201.2

A

1000-3096(2022)04-0133-10

10.11759/hykx20200912002

2020-09-12;

2021-04-16

山东省现代农业产业技术体系刺参产业创新团队建设项目(SDAIT-22-07)

[Construction Program Stichopus japonicus Industrial Innovation Team of Modern Agricultural Industrial Technology System of Shandong Province, No. SDAIT-22-07]

钟静诗, (1997—), 女, 广东惠州人, 硕士研究生, 主要从事食品工程研究, E-mail: 465369582@qq.com; 张健(1980—),通信作者, 山东临沂人, 博士, 副研究员, 主要从事海洋食品科学研究, E-mail: zjsd408@163.com

(本文编辑: 康亦兼)