Wnt/β-catenin 信号通路表达促进糖尿病足溃疡愈合作用的探讨

冯 波，王 聪，卢增辉，魏 武

（江西省中西医结合医院血管外科 江西 南昌 330003）

糖尿病足是导致糖尿病患者致残、致死的重要并发症之一，糖尿病患者足部溃疡的发生率为2%，溃疡预后较差，3 年生存率在50%左右，其不仅给患者带来巨大痛苦，也给社会带来巨大压力[1]。因此对于糖尿病患者伤口愈合的研究十分必要，但既往研究关于糖尿病创面难愈的机制仍未阐明。研究显示，在伤口愈合过程中Wnt 信号通路起着重要作用，其功能涉及细胞周期调控、凋亡的启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面，从而导致相应生物效应[2-3]。本项目拟通过建立糖尿病足溃疡模型，检测Wnt 信号通路及其相关联的β-连环蛋白（β-catenin）、R-脊椎蛋白3（R-spon din 3,Rspo-3）蛋白及mRNA 表达水平，探讨糖尿病足溃疡的发生机制及其促进糖尿病足溃疡的愈合作用，现报道如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

于2019 年10 月—2020 年6 月构建糖尿病大鼠动物实验模型，以40 只Sd 大鼠（批号：201648151）为试验对象，将大鼠分为糖尿病组及对照组各20 只。大鼠群养于垫锯木屑的饲料笼中，每笼5 只，控制室温22 ℃，相对湿度50%，采用自然光暗周期，自由饮水。大鼠均由江西省中西医结合医院细菌室提供，本研究中实验动物、实验条件、实验方法遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》，本次经院内伦理委员会批准（伦理审批号：2010-院伦审药临字第11 号）。

1.2 方法

（1）大鼠糖尿病模型制备。将大鼠捆缚于鼠板，禁食12 h 后腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）40 mg/（kg·d），正常组、对照组和药物对照组大鼠每天捆绑30 min，并以普通饲料喂养。3 d 后测量血糖，≥16.7 mmol/L 为提示造模成功。（2）糖尿病大鼠足部溃疡模型制备。采用薄铁片连续按压大鼠足部，并用冰醋酸连续涂抹，制作糖尿病足模型，待大鼠下肢出现红肿溃疡等异样变化，根据肢端坏疽情况参考Wagner评分对各给药组及模型组大鼠四肢进行评估。分成5 级，0 ～5 级分别0 级表示目前无溃疡；1 级表示足部皮肤颜色呈苍白或紫绀状；2 级表示有溃疡，出现表浅的创面；3 分表示溃疡出现深部感染；4 分表示局部坏疽但尚未破坏骨质。5 级表示全足坏疽或形成假关节。于给药前及给药后第1、2、3 周末分别进行评估，计算每只大鼠的总积分。（3）创面愈合情况。创面愈合情况观察创面造模后第3、7、14 d 对创面进行大体观察，主要包括创面颜色、肿胀程度、渗液量等，并用数码相机拍照，通过Photoshop 软件记录创面面积。（4）创面组织学变化。采用免疫组组织化学方法，10%中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋并切成4 μm 厚组织切片，滴加山羊血清封闭30 min。滴加磷脂酰肌醇3-激酶（P-PI3K）/蛋白激酶B（P-Akt）/雷帕霉素靶蛋白（P-mTOR）抗体。二抗采用FITC 标记或生物素标记，采用ABC 法染色。并设置阴性对照、阳性对照和荧光标记物对照组。图像用IMAGE PRO 5.1 软件（Media Cybernetics）分析阳性染色的面积及光密度。免疫组化结果判定：在100 倍放大的显微镜下观察是否着色，后更换400 倍的放大显微镜观察表达部位，p-Akt 与p-mTOR 分别位于细胞浆和细胞质，两者阳性产物均呈棕褐色颗粒。采用Fromowitz 等改良综合计分法制定-、+、++、+++4 个等级，依次表示0 分（阴性）、2 ～3 分（弱阳性）、4 ～5 分（中阳性）、6 ～7 分（强阳性），阳性细胞计分标准：0 ～4分依次表示无阳性细胞、阳性细胞数超过25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，切片表达计分标准：1 ～3 分依次表示切片呈淡黄色、棕黄色、棕褐色[5]。（5）创面组织β-catenin、GSK3β 蛋白的含量检测。分别于创面造模后第3、7和14 d，对大鼠采用戍巴比妥钠进行麻醉后，采集创面及创周2 mm 的组织，应用ELISA 法检测其中β catenin、GSK3β 蛋白的的含量。

1.3 观察指标

（1） 观察两组创面造模后第3、7、14d 的β-catenin（β-连环蛋白）及Rspo-3(R-脊椎蛋白3)含量；（2）观察两组创面造模第3、7、14d 的创面愈合率；（3）观察两组组织病理学结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料采用（± s）表示，两独立样本采用t检验，两组及两组以上采用F检验；计数资料用频数（n）和百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验；生存时间和中位肝转移时间、中位生存期等生存资料分析采用Kaplan-Meier 方法计算，组间生存率的比较采用Log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 两组创面造模后各时间点的β-catenin 及Rspo-3 含量比较

创面造模后第3、7、14d，糖尿病组创面组织中βcatenin、Rspo-3 蛋白含量均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组大鼠创面造模后各时间点的β-catenin 及Rspo-3含量比较 ± s

表1 两组大鼠创面造模后各时间点的β-catenin 及Rspo-3含量比较 ± s

β-catenin/ml第3d第7d第14d对照组202.01±0.822.44±0.712.64±0.41糖尿病组 200.98±4.330.85±0.220.86±0.43 t 4.8494.6136.846 P 0.0010.0010.001组别例数Rspo-3/μg第3d第7d第14d对照组202.25±0.712.04±0.282.28±0.21糖尿病组 200.54±0.820.99±0.300.97±0.32 t 7.2126.8654.623 P 0.0010.0010.001组别例数

2.2 两组创面愈合情况比较

创面造模后第3、7、14d，糖尿病组的创面愈合率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组大鼠创面造模后各时间点的创面愈合率比较（ ± s，%）

表2 两组大鼠创面造模后各时间点的创面愈合率比较（ ± s，%）

组别例数第3d第7d第14d对照组200.025±0.0040.018±0.0030.010±0.006糖尿病组 200.031±0.0050.026±0.0040.019±0.005 t 6.84110.3649.872 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.3 组织病理学结果

换药处理后第7 天，对照组大鼠溃疡面在光镜下呈现出肉芽组织大量炎性细胞渗出，出血显著，见少许血管，管腔细，见坏死带呈团状排列，见图1。糖尿病组溃疡面在光镜下见肉芽组织少量炎症细胞浸润，成纤维细胞出现增殖，且体积较大，见大量新生血管，管腔小且圆，见图2。

图1 对照组大鼠溃疡面光镜图

图2 糖尿病组大鼠溃疡面光镜图

3.讨论

据统计，12%～25%的糖尿病患者会罹患糖尿病足，其不仅给患者带来巨大痛苦，给社会也带来巨大压力，并且该病正随着人们生活水平的提高而呈上升趋势[6]。因此，对于糖尿病患者伤口愈合的研究十分必要。慢性糖尿病患者伤口一般由急性伤口发展而来，但是愈合的过程在不同的阶段都发生了紊乱，导致伤口超过12 个星期不愈合[7]。此外，高糖、慢性炎症、循环系统异常、低氧、神经病变和神经肽信号通路受损也会影响糖尿病患者伤口愈合的进程[8]。

研究表明，Wnt 信号通路中的相关成员对伤口愈合很重要，其中最被熟知的是经典Wnt/β-cateninc-Mye 通路[9]。有研究分析糖尿病大鼠以及正常大鼠的Wnt/βcatenin 信号通路的表达，发现其在糖尿病足溃疡患者愈合过程中呈下降趋势[10]。因此，我们推测激活Wnt/β-catenin 信号通路可能促进创面愈合。基于以上背景，本项目拟基于Wnt/βcatenin 信号通路研究糖尿病足慢性溃疡的机制，选取数只大鼠进行创面造模后。分析结果可知：创面造模后第3、7、14d，糖尿病组创面组织中βcatenin、Rspo-3 蛋白含量均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），与赵亚男等[11]研究发现的高浓度葡萄糖会下调细胞中β-catenin 蛋白表达的结论一致。其中β-catenin 是Wnt 通路中重要的下游因子，属于一种多功能蛋白质，其胞浆内分子量为92 ～95 kd，增强β-catenin 稳定性的主要机制是依靠Wnt信号通路刺激，该指标与皮肤损伤及愈合间关系密切，其大量分泌的情况下有助于促进表皮及角质细胞的生成，促使皮肤愈合。而Rspo3 属于Rspo 蛋白家族，具有激活Wnt 途径的作用。在本实验中发现，Rspo3 在糖尿病溃疡大鼠创面组织中呈低表达，由此，我们推推测，Rspo 蛋白的调降可能是下调糖尿病溃疡中Wnt 信号通路的主要机制[12]。在本实验中糖尿病组的创面愈合率均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且溃疡愈合延缓，肉芽生长不佳，证实糖尿病皮肤创面细胞凋亡增加，也从侧面认可了本实验模型制造的成功。

综上所述，Wnt/β-catenin 信号通路表达下调，参与了糖尿病足溃疡愈合不良的过程。