基于广泛靶向代谢组学的武穴野生山药及其零余子代谢物差异分析

靳晓杰，张静珍，2，杨新笋，*

(1.湖北省农业科学院 粮食作物研究所，湖北 武汉 430064； 2.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

山药(Turcz.)别名薯蓣，是薯蓣科薯蓣属一年生或多年生藤本植物，其地下块茎是我国传统的药食同源食物之一。山药除作为食物为人类提供能量和营养，亦是一味传统中药材，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功效；其零余子俗称山药豆，是山药植株地上叶腋间的珠芽。有研究表明，零余子亦可用作食补，其药用成份与山药大致相同，药用功效也与山药大致相同。据《本草拾遗》记载，山药零余子补虚损、强腰脚、益肾、食之不饥，且晒干后功效强于山药。

山药块茎与其零余子中含有的初生代谢物和次生代谢物是决定其营养价值和药用价值的物质基础。山药块茎中含有多糖、尿囊素、薯蓣皂苷、黄酮、多酚等多种生物活性物质，可用于预防和治疗糖尿病、肾炎、癌症等多种疾病。而山药皮中含有较高的尿囊素、总黄酮和总多酚，以及其特有的菲类化合物，使其较山药块茎肉质具有更强的抗肿瘤和抗炎活性。但这些研究主要以一种或几种化合物的鉴定为研究目的，通量较低，对山药皮和山药零余子中代谢物的种类了解尚不全面。

代谢组学是通过大量小分子代谢物的定性、定量分析来研究生物体内代谢物的种类、含量及其在内外因素作用下的变化规律。腊贵晓等利用UPLC-QTOF技术对铁棍山药和太谷山药的代谢成分进行分析，发现8种差异代谢物，其中3种已知代谢物为植酸、麦解甾醇和豆固醇。An等利用NMR技术分析了铁棍山药皮和肉的42种代谢成分，发现13种代谢成分在山药皮和山药肉中存在显著差异。以上研究均以铁棍山药为研究材料，而其他特色山药的代谢物含量由于山药种类不同，其含量存在差异，特别是自然生长的野生山药及其零余子的代谢成分仍然缺少全面了解。

湖北省武穴市是佛手山药的主产地，同时还有丰富的野生山药资源，当地农民多有采食和出售野生山药的习惯，但关于当地野生山药的营养特性和药用特性的研究尚未见报道。本研究利用LC-MS/MS方法对湖北省武穴市的一份野生山药及其零余子进行代谢组检测与分析，从而系统地研究武穴野生山药及其零余子中各代谢产物的种类和相对含量，为更好地利用其营养成分和药用成分提供物质依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

实验所用野生山药及其零余子采集于湖北省武穴市，为薯蓣类山药。材料采集后迅速用无菌水冲洗擦干，立即放入液氮中进行冷冻处理，随后经真空冷冻干燥后，对山药块茎进行皮肉分离，最终获得山药肉(rhizome flesh， RF)、山药皮(rhizome peel， RP)和零余子(bulbil， BA)3组样品，每组样品取3次生物学重复。

1.2 测定方法

1.2.1 代谢样提取

使用研磨仪(Schwingmühle Tissue Lyser II， Germany)将冻干样品研磨至粉末状(29Hz，50s)。称取100 mg样品粉末，与1mL体积分数70%的甲醇溶液(预先加入0.1 mg·L阿昔洛韦作为内标)混合，涡旋振荡3次后于4℃放置10 h。随后9 500×离心10 min，取上清通过0.22 μm滤膜过滤得最终制备样，用于LC-MS/MS分析。

1.2.2 LC-MS/MS检测

采用LC-ESI-MS/MS系统(HPLC，Shim-packUFLC SHIMADZU CBM20A system，5500 Q TRAP)进行检测。参照Chen等的方法，使用逐步多离子监控器增强的产物离子来构建MS2T库；使用飞行时间质谱平台(HPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZUCBM20A系统，三重TOF 5600)获得每个前体离子的准确m/z；使用预定的多反应监测方法(MRM)对代谢产物进行定量。在Analyst 1.5软件中，使用预定的MRM算法，MRM的检测窗口为90 s，目标扫描时间为1.0 s。

1.3 数据分析

使用SIMCA-P 14.1软件进行代谢产物的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析，计算OPLS-DA模型中各代谢物的VIP值(variable important in projection)。利用MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca)在线平台进行单变量分析和层次聚类分析(HCA)等。利用多元统计VIP≥1、单变量统计FDR≤0.05且差异倍数(fold change， FC)≥2或≤0.5筛选零余子与山药肉间(BA/RF)，以及山药皮与山药肉间(RP/RF)的差异代谢物。使用在线软件Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtoolsVenn)绘制韦恩图。

2 结果与分析

2.1 LC-MS/MS检测结果

利用LC-MS/MS在野生山药的山药肉、山药皮和零余子中共检测到385种代谢物，其中，山药肉中检测到374种代谢物，山药皮中检测到367种代谢物，零余子中检测到381种代谢物，分别属于氨基酸及其衍生物、黄酮类、脂质、核苷酸及其衍生物等11类(图1，表1)。共有355种代谢物在山药肉、山药皮和零余子中均检测到。

2.2 代谢物的多元统计分析

PCA分析结果如图2-A所示，PC1和PC2可解释各代谢物64.3%的总变异，说明该模型可以较好地将样本划分为山药肉、山药皮和零余子3组。聚类热图结果显示，同一组织的样品聚类成一组，且代谢物在不同样品组间的相对含量有明显差异。通过检测到的代谢物可将山药肉、山药皮和零余子分为2大类，其中山药肉与零余子聚为一大类，山药皮为另一大类。这说明大量的代谢物在山药肉、山药皮和零余子中的相对含量存在偏好性(图2-B)。

BA，零余子；RP，山药皮；RF，山药肉。下同。BA，Bulbil;RP，Rhizome peel;RF，Rhizome flesh.The same as below.图1 野生山药中代谢物数量韦恩图Fig.1 Venn diagram of the metabolites in wild Chinese yam

表1 野生山药中代谢物分类

采用OPLS-DA方法进行有监督的差别统计分析，其中，零余子/山药肉组的RX=0.721、RY=0.999、Q=0.961，山药皮/山药肉组的RX=0.724、RY=1、Q=0.994，模型拟合效果较好，能够很好地区分不同样品组间代谢物的差异(图3)。

2.3 差异代谢物筛选与分析

以VIP≥1、FDR≤0.05且|logFC|≥1为阈值，在零余子与山药肉间共筛选到70种差异代谢物，在山药皮与山药肉间共筛选到81种差异代谢物，其中，有26种代谢物在山药皮/山药肉和零余子/山药肉中均存在显著差异(图4)。

A，PCA得分图；B，层次聚类热图。A， PCA score plot; B，Hierarchical clustering heatmap.图2 野生山药及其零余子中代谢物的PCA图和聚类热图Fig.2 PCA plot and heatmap of metabolites in rhizome and bulbil of wild Chinese yam

A，BA/RF组；B，RP/RF组。A，BA/RF group; B， RP/RF group.图3 两个对比组的OPLS-DA得分图Fig.3 OPLS-DA score plot of two comparison groups

在零余子/山药肉组中共筛选到70种差异代谢物，其中，43种代谢物表现为上调，即在零余子中相对含量较高，主要为黄酮类(18种)、核苷酸及其衍生物类(6种)、有机酸类(5种)和其他类(9种)；另外27种代谢物表现为下调，即在山药肉中相对含量较高，主要为氨基酸及其衍生物类(9种)、有机酸类(5种)和其他类(6种)。所有的黄酮类、核苷酸及其衍生物类、脂质类和维生素及其衍生物类差异代谢物均为上调；除哌啶酸外，其余氨基酸及其衍生物类差异代谢物均为下调(图4-A)。在零余子/山药肉组中差异最大的前20种代谢物中，除缬氨酸和甲硫氨酸下调外，其他18种代谢物均上调，且主要为黄酮类(10种)(表2)。

共81种代谢物在山药皮/山药肉组中达显著差异水平。其中，46种代谢物表现为上调，即在山药皮中相对含量较高，主要为黄酮类(12种)和其他类(13种)；35种代谢物下调，即在山药肉中相对含量较高，主要为氨基酸类(16种)和其他类(7种)。除leucyl-tryptophan外，其余氨基酸及其衍生物类代谢物均表现为下调(图4-B)。山药皮/山药肉中差异最大的前20种代谢物中，有16种代谢物在山药皮中相对含量高于山药肉中，仅精氨酸、糠酸、戊烯二酸和3-[ethyl(nitroso)amino]propanoic acid 4种代谢物在山药肉中相对含量较高(表3)。

A，零余子/山药肉；B，山药皮/山药肉。A，Bulbil/Rhizome flesh; B，Rhizome peel/Rhizome flesh.图4 差异代谢物热图Fig.4 Heatmap of differentially accumulated metabolites

3 结论与讨论

本研究通过LC-MS/MS分析平台对采自湖北省武穴市的野生山药植株的山药肉、山药皮和零余子中的代谢产物进行广靶代谢组学分析，共检测到385种代谢物。检测到的代谢物数量较之前研究大大增加，且多种代谢物为首次在山药中被检测到。这些将为全面了解山药的营养价值和药用价值提供物质依据。

表2 零余子和山药肉中差异最大的前20种代谢物

表3 山药皮和山药肉中差异最大的前20种代谢物

山药富含多种氨基酸。本研究将零余子与山药肉中氨基酸相对含量进行比较发现，山药肉中富含缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸4种人体必需氨基酸，以及丙氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸3种非必需氨基酸。特别是缬氨酸和甲硫氨酸在山药肉中含量分别是零余子中含量的45.89倍和46.53倍。此外，山药肉中还富含S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)即活性甲硫氨酸，它是人体内最重要的甲基供体，参与生物体内多个生化反应。临床研究表明，SAMe对慢性肝病、抑郁症和骨关节炎等均具有较好的治疗效果。An等利用NMR技术对铁棍山药的山药皮和山药肉进行差异代谢分析发现，铁棍山药的山药皮中富含苏氨酸，山药肉中富含亮氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸。本研究结果显示，武穴野生山药的山药肉中精氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸的相对含量均显著高于山药皮中的相对含量，特别是精氨酸，其在山药肉中的相对含量是山药皮中的60.55倍。说明武穴野生山药的山药肉中富含多种氨基酸及其衍生物，日常食用去皮山药可为人们提供丰富的氨基酸类营养物质。

零余子因其体积小，被认为商品价值不高，大部分被用作饲料或扔掉，而在功能成分方面研究较少，未能得到有效利用。本研究通过LC-MS/MS在武穴野生山药的山药肉和零余子中共检测到54种黄酮类代谢物，其中，18种在零余子和山药肉间存在显著差异，且均表现为上调，即零余子中相对含量较高。异柚葡糖苷、C-hexosyl-chrysoeriol 5-O-hexoside、扁蓄苷、C-hexosyl-luteolin O-hexoside、金圣草素-6-C戊苷-8-C-己糖苷等10种黄酮类代谢物在零余子与山药肉中相对含量差异较大。黄酮类化合物可清除自由基，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、治疗糖尿病等多种药理作用。前人研究表明，多种薯蓣属植物(spp.)含有黄酮类生物活性物质，并且这些黄酮类物质具有抗氧化活性。因此，上述黄酮类差异代谢物可使零余子较山药肉具有更强的抗氧化功效。此外，零余子中还富含哌啶酸、维生素B、漆树酸、芥子酸、苹果酸、莽草酸等多种代谢物。这些差异代谢物将为零余子的营养与药用功能提供物质基础。

在山药加工工艺中均有去皮工序，产生的大量山药皮作为废料被丢弃，而不能合理有效利用。Liu等研究发现，山药皮中总黄酮含量高于山药肉中含量。孟永海等通过比较生山药、土炒山药、麸炒山药、蜜麸炒山药去皮前后的总黄酮差异，证明山药皮中含有大量的黄酮类物质。但以上研究仅比较了山药皮和山药肉中总黄酮含量的差异，对山药皮和山药肉中各种黄酮类物质的含量仍缺少了解。本研究在山药肉/山药皮组中共鉴定到16种差异表达的黄酮类代谢物，其中12种在山药皮中相对含量较高，包括C-hexosyl-chrysoeriol 7-O-hexoside、槲皮素-3-甲基醚、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯苷、Phellodensin F、鼠李素、Anisofolin A、柚皮苷、芹菜甙元4′-O-鼠李糖苷、异鼠李素、柚皮素等，它们使得山药皮具有更强的抗氧化活性。此外，山药皮中还富含维生素B、乙酰左旋肉碱、咪唑乙酸、反式玉米素-O-葡糖苷核苷、反式玉米素核苷、3-吲哚丁酸等代谢物。上述代谢物可以为山药皮资源的有效利用提供物质依据，从而延长山药加工产业链，提升山药加工的附加值。

综上所述，武穴薯蓣类野生山药的山药肉中富含缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸等多种氨基酸；相较于山药肉，零余子中富含异柚葡糖苷、C-hexosyl-chrysoeriol 5-O-hexoside、扁蓄苷等18种黄酮类代谢物，山药皮中富含反式玉米素-O-葡糖苷核苷、乙酰左旋肉碱、维生素B2、C-hexosyl-chrysoeriol 7-O-hexoside、槲皮素-3-甲基醚等代谢物。这些差异代谢物将为武穴薯蓣类山药肉的营养功效，以及山药皮和零余子的有效利用提供物质基础。