金华猪肌肉和血清氨基酸谱的发育性变化及其与肌肉生长的相关性

李景上，章啸君，陈胜昌，蒋锦华，项 云，屠平光，楼芳芳，杨 华，肖英平，*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.浙江农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.金华市农业科学研究院 畜牧兽医研究所，浙江 金华 321017； 4.金华市金东区动物防疫检疫站，浙江 金华 321015)

金华猪是分布于浙江中部的著名地方优良品种，与瘦肉型外来品种猪相比，具有体脂沉积能力强、瘦肉率低等特征；因此，金华猪的氨基酸代谢和肌肉生长发育特征可能不同于外来品种猪。但是，目前关于金华猪等中国地方品种猪的氨基酸谱和肌肉发育性变化的知识并不丰富，对二者的相关性也不清楚。为此，本试验选择不同生长阶段的金华猪，探究其血清游离氨基酸谱和肌肉水解氨基酸谱的发育性变化，通过分析其与肌肉生长的相关性，以期为揭示氨基酸在调控猪肌肉生长代谢过程中的潜在作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与样品采集

在金华市农业科学研究院试验猪场选择相同批次的60头金华猪仔猪进行饲养，饲养期间自由采食、饮水。分别于日龄45 d(保育阶段)、90 d(生长阶段)、150 d(育肥阶段)和270 d(商品猪阶段)各随机选择4头金华猪进行采样。参照Xiao等的血清样品采集方法，采样前禁食12 h，从前腔静脉采集血液样本，于4 ℃、3 000×离心10 min获得血清样品，-80 ℃保存，用于游离氨基酸及其衍生物的测定；参照朱晓艳等的方法，取左侧胴体倒数第三到第四腰椎处背最长肌样品，液氮速冻后，-20 ℃冰箱保存，用于肌肉水解氨基酸的测定。

1.2 眼肌面积测定

选定胸腰椎结合处背最长肌横截面，参照程娜等的方法，测定并计算眼肌面积。

1.3 水解氨基酸测定

背最长肌样品解冻后，参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行前处理，用日立L-8900氨基酸自动分析仪(日本Hitachi)测定肌肉中的水解氨基酸含量。

1.4 血清中的游离氨基酸及其衍生物测定

参照肖英平等的方法测定血清中的游离氨基酸及其衍生物浓度。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平选定为α=0.05。利用R-studio软件开展主成分分析(PCA)，探寻不同生长阶段肌肉水解氨基酸和血清游离氨基酸及其衍生物的变化。

2 结果与分析

2.1 眼肌面积的发育性变化

随着日龄增加，金华猪眼肌面积显著(<0.05)增大，在45、90、150、270日龄时，金华猪的平均眼肌面积分别为(11.15±0.93)、(22.75±1.18)、(26.71±1.16)、(30.54±0.44)cm(图1)。

2.2 背最长肌氨基酸的发育性变化

在9种必需氨基酸中：在45日龄至90日龄，金华猪背最长肌的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸含量显著(<0.05)升高(表1)，增幅分别为23.89%、21.90%、19.89%、80.50%、18.56%；在90日龄至150日龄，组氨酸与精氨酸含量显著(<0.05)降低，降幅分别为45.61%、24.18%；在150日龄至270日龄，组氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为41.94%、46.55%、16.28%、19.44%、23.00%，而甲硫氨酸含量显著(<0.05)降低，降幅为82.17%。在非必需氨基酸中：在45日龄至90日龄，金华猪背最长肌的天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为20.48%、19.89%、18.89%、19.59%、14.92%、32.73%；在90日龄至150日龄，天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量显著(<0.05)降低，降幅分别为12.65%、12.15%、9.09%、21.92%；在150日龄至270日龄，天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为14.03%、12.77%、19.30%。总的来看，从45日龄到270日龄，必需氨基酸和总氨基酸的含量先升高后降低，在90日龄阶段含量最高，显著(<0.05)高于其他时段；而非必需氨基酸的含量先升高后降低然后又升高。

柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。Bars marked without the same letters indicated significant difference within treatments at P<0.05.图1 不同生长阶段金华猪的眼肌面积Fig.1 Ribeye areas of Jinhua pig at different growth stages

PCA分析结果(图2)显示，不同日龄金华猪背最长肌的水解氨基酸谱差异明显，可直接聚为不同的类别。

2.3 不同生长阶段金华猪血清游离氨基酸及其衍生物的发育性变化

在9种必需氨基酸中：在45日龄至90日龄，金华猪血清的各必需氨基酸含量均无显著变化(表2)；在90日龄至150日龄，缬氨酸、亮氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为39.98%、18.87%；在150日龄至270日龄，缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为32.45%、20.33%、32.89%。在非必需氨基酸中：在45日龄至90日龄，金华猪血清的谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸含量显著(<0.05)降低，降幅分别为30.83%、45.13%、37.73%；在90日龄至150日龄，甘氨酸、酪氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为53.81%、13.94%；在150日龄至270日龄，天冬氨酸、谷氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为97.75%、59.11%，而脯氨酸含量显著(<0.05)降低，降幅为31.90%。总的来看，从45日龄到270日龄，必需氨基酸含量在45日龄到150日龄无显著变化，之后显著上升；非必需氨基酸含量在45日龄到150日龄先显著(<0.05)降低后显著(<0.05)升高，从150日龄到270日龄无显著变化；总氨基酸含量先显著(<0.05)降低，至90日龄达最低值，之后显著(<0.05)升高。

表1 不同生长阶段金华猪背最长肌氨基酸的发育性变化

D45、D90、D150、D270分别表示45日龄、90日龄、150日龄、270日龄。下同。D45， D90， D150， D270 indicates 45， 90， 150， 270 days of age. The same as below.图2 不同生长阶段金华猪背最长肌氨基酸主成分分析得分图Fig.2 PCA score chart of amino acids in longissimus dorsi of Jinhua pigs at different growth stages

在45日龄至90日龄，金华猪血清的鸟氨酸、羟脯氨酸、1-甲基组氨酸、磷酸丝氨酸含量显著(<0.05)下降(表3)，降幅分别为32.84%、32.75%、32.24%、25.37%，尿素含量显著(<0.05)升高，增幅为83.97%；在90日龄至150日龄，瓜氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅为40.53%，-丙氨酸含量显著(<0.05)下降，降幅为36.31%；在150日龄至270日龄，牛磺酸、乙醇胺、3-甲基组氨酸、磷酸丝氨酸含量显著(<0.05)升高，增幅分别为44.27%、30.29%、38.33%、103.87%，-氨基正丁酸、羟脯氨酸、1-甲基组氨酸含量显著(<0.05)下降，降幅分别为90.00%、44.40%、66.38%。

表2 不同生长阶段金华猪血清游离氨基酸的发育性变化

表3 不同生长阶段金华猪血清氨基酸衍生物的发育性变化

PCA分析结果(图3)显示，不同日龄金华猪血清中的游离氨基酸及其衍生物差异明显，可直接聚为不同的类别。

图3 不同生长阶段金华猪血清中游离氨基酸及其衍生物的主成分分析得分图Fig.3 PCA score chart of serum free amino acids and their derivatives of Jinhua pigs at different growth stages

2.4 氨基酸与眼肌面积的相关性

将金华猪眼肌面积分别与肌肉水解氨基酸、血清游离氨基酸含量进行相关性分析(图4)，结果显示：肌肉和血清中的精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸含量均与眼肌面积呈正相关(相关系数在0.03～0.84)，肌肉中缬氨酸含量与眼肌面积的相关系数最高(0.69)，血清中精氨酸含量与眼肌面积的相关系数最高(0.84)。

图4 不同生长阶段金华猪肌肉氨基酸、血清氨基酸含量与眼肌面积的相关性Fig.4 Correlation analysis of muscle amino acids， serum amino acids and ribeye areas of Jinhua pigs at different growth stages

3 讨论

肌肉是参与机体生长发育的重要组织，主要由水(约占75%)、蛋白质(约占20%)和无机盐、矿物质、脂肪与碳水化合物等(合计约占5%)组成。根据猪的生长发育规律，在生长早期，肌肉快速增长，而在后期，肌肉的生长速度降低。本试验结果显示，金华猪的眼肌面积随着日龄的增加而显著增大，这与前人研究结果相似。氨基酸作为机体代谢和神经传递中重要的小分子物质，在生命活动中发挥着重要作用。同时，氨基酸也可在动物体内经过一系列复杂的生化反应合成其他活性物质，如激素、小分子含氮物质等，参与生长发育的调控。蛋白质是肌肉的重要组成成分，而氨基酸是蛋白质的基本单位，由此可推知，肌肉的生长发育应与氨基酸的代谢密切相关。在本研究中，PCA分析的结果直观显示，在不同生长阶段，金华猪肌肉和血清中的氨基酸具有显著的聚类差异，这表明，不同生长阶段金华猪的氨基酸代谢存在明显差异。本研究中，金华猪肌肉中的水解氨基酸总含量呈现出先升高后降低的变化趋势，在90日龄达到最大值；而血清中的游离总氨基酸含量呈现出先降低后升高的变化趋势，在270日龄达到最大值。这可能是因为，猪血清中的游离氨基酸会进入到肌肉中沉积，因此金华猪90日龄阶段血清中的游离氨基酸含量降低，而同期的肌肉氨基酸含量显著升高。布丽君等发现，荣昌猪从出生到50日龄，精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量增幅最大，但在150日龄之后含量逐渐降低，这与本文试验结果有相似之处。本试验结果显示，肌肉中甲硫氨酸的含量在45日龄至150日龄阶段显著高于270日龄阶段。高水平的甲硫氨酸可促进胰岛素样生长因子(1)表达，刺激雷帕霉素靶()信号通路，降低肌肉生长抑制素(the myostatin-Smad 2/3)表达，促进肌肉生长；到了猪生长后期，肌肉生长减缓，相应地，甲硫氨酸的含量也降低。缬氨酸是人类和动物的重要营养物质，在脂质和蛋白质代谢的平衡调节中起着重要的作用。缬氨酸含量增加，导致氨基酸转运蛋白的表达和肌肉蛋白的合成升高。本试验中，缬氨酸与肌肉生长发育表现出高度正相关性，与Zhang等和Duan等的结果一致。Volpi等使用环-H苯丙氨酸输注股动脉和导静脉，在基础状态和氨基酸输注期间测量肌肉蛋白质代谢，发现苯丙氨酸是影响肌肉合成代谢的一个重要因素。这与本试验中苯丙氨酸与肌肉生长发育相关的结果一致。

血液中的氨基酸多被用来评估动物生理状态和机体的氨基酸需要量。Escobar等提出，氨基酸转运蛋白和-1代谢途径可用来调控动物体内的氨基酸代谢。精氨酸在哺乳动物中被归类为半必需或条件必需氨基酸。Chen等在21日龄仔猪(长白×约克夏)上的研究发现，精氨酸通过Akirin2和AMP-activated蛋白激酶()信号通路，在肌肉卫星细胞中促进肌球蛋白重链的表达。本文中，血清中的游离精氨酸含量与眼肌面积高度相关，但其是否与上述信号通路相关，还值得进一步探究。亮氨酸是调节肌肉生长中代谢途径的中间体。Yin等发现，向日粮中添加0.55%的亮氨酸，通过诱导核糖体蛋白S6激酶1和4结合蛋白活化，可促进仔猪背最长肌的蛋白合成。本研究中，血清中的亮氨酸含量呈现出先降低后增高的变化趋势，可能是肌肉在生长过程中，利用血清中的亮氨酸进行蛋白质合成代谢，导致45日龄至90日龄阶段血清中的亮氨酸含量降低。