井穴放血减轻全身炎症反应防治大鼠心脏骤停后脑损伤

钟晓芃,郭义

(1.天津市人民医院,天津 300121;2.天津中医药大学,天津 301617)

随着诊疗技术的提高,心脏骤停患者得到了很好的救治[1]。但是部分患者虽然恢复了心跳、呼吸和血压,往往遗留神经功能障碍,甚至昏迷及脑死亡,被称为心肺复苏后脑损伤[2],严重影响了患者的生活质量,并造成巨大的社会负担[3],因此目前更加重视复苏后神经功能的保护[4]。亚低温作为目前唯一推荐的治疗手段[5],技术复杂不便于推广[6]。

十二井穴刺络放血用于急救在我国有着悠久的历史,其简捷、高效,长于院外急救、自救及他救,弥补了现代医学的不足。明代朱权所撰《乾坤生意》:“凡中风跌倒,卒暴昏沉、痰涎壅滞、不省人事、牙关紧闭、药水不下,急以三棱针,刺手十指十二井穴,当去恶血,治一切暴死恶候,不省人事,及绞肠痧,乃起死回生妙诀”,现代研究中也发现该疗法对于卒中[7-8]、颅脑外伤[9]及一氧化碳中毒[10]造成的神经功能障碍有着良好的治疗作用。

然而手十二井穴刺络放血对心肺复苏后脑损伤是否有治疗作用尚未见报道。本研究观察了手十二井穴刺络放血对于心脏骤停复苏后大鼠神经功能障碍评分及大脑海马区神经细胞坏死凋亡的干预作用,及其对血清白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平的调节,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠18只,体质量(340±50)g,购自北京维通利华实验动物有限公司,许可证号为SCXK(京)2016-0006,饲养于天津易生源生物科技有限公司动物实验室温度18～22 ℃,湿度50%～60%。本实验经天津市人民医院实验动物伦理委员会审批同意。18只大鼠随机分为假手术组、模型组和井穴组3组,每组6只。

1.2 主要试剂与仪器

肾上腺素(天津金耀药业有限公司,国药准字H12020526),大鼠IL-6 ELISA酶联免疫检测试剂盒(宸功生物, CGE20064),大鼠TNF-α ELISA酶联免疫检测试剂盒(Peprotech, 315-01A),原位细胞凋亡检测试剂盒(ROCHE, 11684817910),光学显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11)。

1.3 造模方法

大鼠诱导心脏骤停及心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation, CPR)方法依照Utstein动物CPR实验指南[11]。SD大鼠术前禁食但不禁水,戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔内麻醉,备皮,仰卧位固定。经口直视插入14号气管鞘管。左股动脉置入23号PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理监测仪监测动脉血压,心电图和直肠温度。手术完成后,待大鼠生理参数稳定开始夹闭气管插管,观察大鼠呼吸、心搏和血压,心搏停止以动脉收缩压＜20 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)作为心脏骤停标准。心搏骤停后开始进行心肺复苏,频率为 200次/min的胸外按压和100次/min的同步机械通气,按压深度为胸廓前后径的1/3,吸入氧浓度100%。按压2 min后,予肾上腺素0.025 mg/kg静脉注射,持续按压通气10 min,期间如出现室颤,立即给予 2J的双向波除颤,如自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation, ROSC)则停止按压,10 min未恢复自主循环宣布复苏失败。ROSC定义为恢复室上性心律,平均动脉压(MAP)＞60 mmHg,维持5 min以上。复苏成功的动物连续监测血流动力学 1 h,术毕拔除所有插管,苏醒后放回笼中饲养,使用自制保温设备使动物肛温保持在 36.5 ℃左右。

1.4 干预方法

假手术组只行气管插管,不诱导心脏骤停和 CPR;模型组采用气管夹闭窒息法诱导心脏骤停后进行常规CPR;井穴组采用气管夹闭窒息法诱导心脏骤停后进行常规CPR,复苏后1 h、24 h、48 h进行前肢十二井穴放血。十二井穴放血参考《实验针灸学》[12]在心肺复苏后脑损伤模型建立后1 h后,将采血针垂直插入皮肤,两侧取穴的末端深度为 1 mm,以少商、商阳、中冲、关冲、少冲、少泽的顺序。参考《实验针灸学》[12]动物腧穴定位及既往文献[9],每个穴位分别挤压3～5次,出血量为 15～20 μL。假手术组和模型组的大鼠以相同的强度抓握,而穴位不刺血。

1.5 样本采集

复苏后6 h、24 h、48 h、72 h经鼠尾静脉取血0.5 mL,置4 ℃ 1 500 r/min离心15 min,分离血清,-20 ℃冰箱保存待测。72 h后迅速断头取脑,剥离左右大脑半球,常规脱水石蜡包埋,切片至出现海马组织,每隔5张留取1张。

1.6 观测指标

1.6.1 血压和平均动脉压检测

左股动脉置入 23号 PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理监测仪监测动脉血压和心率。

1.6.2 神经功能缺陷评分

在大鼠复苏后6 h、24 h、48 h及72 h被处死之前进行评估。神经缺陷评分范围为0～80(80表示正常大脑功能),是基于唤醒,神经系统反射,运动功能和简单行为反射的测试。每组大鼠根据神经功能缺陷评分表独立评分,取平均值,获得最终的神经缺陷分数[13]。

1.6.3 尼氏染色

将 5 μm石蜡切片常规脱蜡。用移液器在组织上滴加适量尼氏染液,染色8 min,ddH2O溶液洗涤2次,每次 30 s。再将切片分别置于 95%乙醇溶液Ⅰ、95%乙醇溶液Ⅱ、二甲苯溶液Ⅰ、二甲苯溶液Ⅱ中脱水透明,最后滴加中性树胶,用盖玻片封片。待自然风干后在光学显微镜观察拍照。

1.6.4 TUNEL法检测大鼠海马神经细胞凋亡

取海马组织使用4%甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋,切片,按照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书行 TUNEL检测。每组大鼠取6张切片,显微镜下观察大脑皮层神经元的形态,胞核成深棕色的细胞即为凋亡细胞,根据SOSLOW RA[14]方法计算凋亡指数。

1.6.5 血清IL-6、TNF-α水平检测

血液自然凝固后以3 000 r/min离心10 min,取上清液,-20 ℃冷藏。采用ELISA法检测血清IL-6、TNF-α水平。严格按照试剂盒说明书操作步骤进行操作,最后用普朗 DNM-9602酶标仪进行检测,以空白孔调零,450 nm波长测每孔OD值。

1.7 统计学方法

采用 GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,对于不同时间点数据采用重复测量方差分析,其他数据采用单因素方差分析(OneWay-ANOVA),组间两两比较采用Tukey's检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠心率和平均动脉压的改变

复苏前 3组大鼠心率及平均动脉压比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。复苏后6 h、24 h、48 h与假手术组比较,模型组和井穴组大鼠心率和平均动脉压均下降,差异有统计学意义(P＜0.05),至复苏后 72 h与假手术组比较,井穴组平均动脉压比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与模型组比较,井穴组平均动脉压升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 3组大鼠不同时间点心率和平均动脉压水平比较 (±s)

表1 3组大鼠不同时间点心率和平均动脉压水平比较 (±s)

注:与假手术组比较 1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

项目 组别 n 复苏前 6 h 24 h心率(次/分)假手术组 6 317.33±11.81 343.83±17.82 342.67±14.27模型组 6 335.67±15.46 194.50±13.171) 219.67±15.111)井穴组 6 338.17±13.53 213.67±10.231) 250.00±12.151)2)平均动脉压(mmHg)假手术组 6 106.67±9.18 104.17±8.68 104.00±8.12模型组 6 104.67±7.20 71.67±7.841) 80.17±11.021)井穴组 6 106.33±9.37 86.50±4.371) 90.33±4.381)48 h 72 h 334.50±20.36 333.67±11.47 252.00±15.521) 274.00±19.781)261.67±14.401) 288.67±11.271)101.50±9.14 105.00±8.32 83.33±9.071) 90.00±2.371)90.67±4.321) 105.17±7.332)

2.2 3组大鼠神经缺陷分数的变化

复苏前各组大鼠神经功能缺陷评分比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。复苏后与假手术组比较,模型组和井穴组经功能缺陷评分均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05)。其中6 h最为明显,至72 h与假手术组比较,井穴组神经功能缺陷评分比较,差异无统计学意义(P＞0.05),而模型组显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表2。

表2 3组大鼠复苏不同时间点神经功能缺陷评分水平比较 (±s,分)

表2 3组大鼠复苏不同时间点神经功能缺陷评分水平比较 (±s,分)

注:与假手术组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

组别 n 复苏前 6 h 24 h 48 h 72 h假手术组 6 77.75±1.08 78.00±0.71 78.25±0.82 78.00±0.89 78.33±1.17模型组 6 78.25±0.76 29.83±3.721) 41.83±3.371) 48.33±5.791) 58.17±2.111)井穴组 6 78.00±1.14 33.25±2.141) 45.83±1.371)2) 56.7±2.701)2) 74.58±5.302)

2.3 3组大鼠海马神经细胞尼氏染色观察

甲苯胺蓝染色显示,假手术组大鼠海马神经元细胞胞质内可见深蓝色斑块状或虎斑样尼氏体,细胞核大,核仁明显;模型组大鼠海马神经元细胞胞质内尼氏小体固缩坏死,溶解、液化后形成空泡样结构;与模型组比较,井穴组大鼠脑组织神经元水肿较轻,神经元形态较好,仅见少量空泡样改变,有部分神经元细胞核肿大,核仁消失。详见图1。

图1 3组大鼠海马神经细胞尼氏染色观察(×400)

2.4 3组大鼠海马神经细胞凋亡情况

复苏72 h后与假手术组比较,模型组和井穴组凋亡指数显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,井穴组凋亡指数显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。详见图2、图3。

图2 3组大鼠海马神经细胞凋亡情况观察(TUNEL法染色,×400)

图3 3组大鼠凋亡指数比较

2.5 3组大鼠复苏不同时间点血清IL-6、TNF-α水平比较

随着复苏时间延长,模型组和井穴组血清 IL-6、TNF-α水平均呈先升高后降低的趋势,IL-6于复苏后24 h达峰值,TNF-α于复苏后 48 h达峰值,复苏后72 h均降低。自复苏后6 h开始,与假手术组比较,模型组和井穴组血清IL-6、TNF-α水平显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较,井穴组血清IL-6于复苏后24 h、72 h,血清TNF-α于复苏后24 h、48 h、72 h均显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05),两组在实验结束时血清 IL-6、TNF-α均未恢复到正常水平。详见表3。

表3 3组大鼠复苏不同时间点血清IL-6和TNF-α水平比较 (±s, ng/L)

表3 3组大鼠复苏不同时间点血清IL-6和TNF-α水平比较 (±s, ng/L)

注:与假手术组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05

项目 n 组别 复苏前 6 h 24 h 48 h 72 h IL-6 6 假手术组 20.98±0.99 20.94±1.02 21.64±0.87 21.70±0.95 21.78±1.37 6 模型组 20.94±1.02 63.57±4.161) 94.94±6.421) 80.79±3.291) 70.97±3.801)6 井穴组 21.00±2.23 62.50±3.231) 86.05±9.551)2) 75.78±6.881) 62.1±10.131)2)TNF-α 6 假手术组 19.21±2.00 18.32±1.39 18.65±2.02 17.41±1.68 17.48±2.31 6 模型组 17.50±1.23 47.50±2.511) 58.90±2.231) 88.82±2.111) 68.65±4.241)6 井穴组 17.93±2.39 43.19±3.411) 50.86±5.591)2) 77.68±8.411)2) 61.85±8.021)2)

3 讨论

《医宗金鉴》指出:“商阳主刺卒中风,暴仆昏沉痰涎壅,少商、中冲、关冲、少泽、商阳,使气血流行,乃起死回生救急之妙穴。”心脏骤停在中医学属于“厥症”范畴,基本病机为气血阴阳不相顺接,阴阳离绝[15]。经心肺复苏呼吸循环恢复后患者气血阴阳初复,气血运行无力,易出现瘀血痰浊上蒙清窍,故仍昏迷不醒。《灵枢·九针十二原》:“病在脏者,取之井。”手十二井穴位于手三阴三阳经交汇处刺络放血可调整阴阳,开窍醒神[16]。此时应用手十二井穴刺络放血可续接阴阳,活血祛瘀,化痰开窍,促进患者苏醒,神经功能恢复。

本研究采用经典窒息法[17]诱导心跳骤停,制作复苏后脑损伤动物模型,与假手术组相比模型组心率及血压降低、神经功能评分减少、大脑海马区凋亡细胞明显增多,尼氏染色显示海马区神经元细胞坏死溶解液化明显增多,提示造模成功。而手十二井穴刺络放血组与模型组比较心率及血压升高、神经功能评分增高,大脑海马区尼氏染色显示神经元细胞坏死溶解液化减少,TUNEL法检测凋亡细胞明显减少,提示手十二井穴刺络放血对复苏后脑损伤有明显的防治作用。

研究表明心跳骤停复苏成功后,机体经历了缺血再灌注过程,复苏后全身各脏器的再灌注损伤产生大量氧自由基、乳酸、花生四烯酸的代谢产物等炎性介质,导致全身的炎症反应[18-19],心脏骤停1 h后,血液中细胞因子 IL-6和 TNF-α会迅速升高[20-22]。TNF-α可以诱导白细胞介素和次级炎症介质的合成,高表达时会产生严重的神经毒性[23-24],IL-6可引起神经系统的损伤[25],引起中枢神经细胞发生调亡[26],有研究表明手十二井穴刺络放血可调节患者血清 IL-6、TNF-α水平治疗丘脑梗死神经后遗症[27-28]。本研究结果提示,大鼠心跳骤停复苏后6 h、24 h、48 h、72 h时血液中细胞因子IL-6和TNF-α与假手术组相比明显升高。其中6 h升高最为明显,与之对应的神经功能缺陷评分也最低。而井穴组与模型组相比,血清IL-6和TNF-α水平减少,海马区神经元凋亡细胞减少,神经功能恢复较好,且差别有统计学意义,这表明手十二井穴刺络放血能够减少炎性细胞因子的升高,减轻中枢神经系统损伤,改善心肺复苏后神经功能障碍。因此本研究认为减轻心脏骤停后机体炎症反应可能是手十二井穴刺络放血防治复苏后脑损伤的机制之一。