广西东山猪的冷冻精液制作要点

文│邓祝新 魏莎 黄丽云 梁志敏 李美珍 李芳芳 王英群 韦慧华 肖丽华 覃孝杰（广西壮族自治区畜禽品种改良站）

广西壮族自治区畜禽品种改良站于2019年11月11日启动了《广西地方家畜品种遗传材料采集与保存》项目工作。全州东山猪遗传材料的采集工作进展顺利，同时结合东山猪的公猪精液特点，在东山猪冷冻精液制作方面取得了一定的经验与效果。

一、公猪精液采集

采精前的准备：集精杯、消毒过滤纱布、一次性消毒手套、毛巾、0.01%高锰酸钾溶液。

采集方法：引导公猪进入采精室，待公猪爬跨时，用毛巾浸泡高锰酸钾水后擦干净公猪下阴部，尽可减少外来污染源。戴上手套，采用手握法采集精液，将纱布盖在集精杯口，收集猪精时，正好起到过滤猪精内胶状物和杂质的目的，通常我们只收集公猪精液浓度最高的中间段，不要采精初段的精清。

二、精液的配液与稀释

根据国家对遗传材料采集相关工作的要求和标准，公猪精液的配液包含以下几项工作：

1.原精稀释液配制。48.5克AndroproPlus＋1升水（32～37℃）混匀，稳定1小时。

2.冷却营养稀释液（A液）的配制。44克AndrohepCryGaurd＋400毫升水（37℃）＋100毫升鸡蛋黄，搅拌均匀，冷却至17℃。

3.冻凝稀释液（B液）的配制。40.7克AndrohepCryGaurd＋400毫升水（37℃）＋100毫升鸡蛋黄，搅拌均匀，加入37.7克甘油（30毫升丙三醇），混匀。再加入5毫升EquexSTM膏，混匀后至4℃冰箱内存放。

4.解冻稀释液配制。50克AndrohepCryGaurd－Thaw＋1升水（26℃），混匀，稳定1小时。

5.稀释步骤。使用的物品：原精稀释液、冷却营养液、冻凝稀释液、解冻稀释液、高速低温离心机、密度仪等。准备：离心管、离心机预冷、冷却营养液、密度仪、两个盆。

精液采集后，用原精稀释液进行第一次等温稀释，稀释后移入17℃的恒温冰箱中平衡30分钟。（摇匀分装到离心管测密度、看活力、配平、离心、弃液、稀释、混匀）。

采集到的新鲜猪精液肉眼观察无异样后做好采精信息登记。将稀释液的温度与新鲜猪精的温度配平，并且常以1∶3稀释后放置于隔热泡沫箱中，装盖严实。及时送达实验室进行镜检分析。同时将实验室的工作环境温度调节在23～25℃。使用移液枪取10微升鲜精，在电子显微镜下观察，综合评定精子活力，通常情况下，活力在0.65以上、无黏连、无杂质的精液可以制作冻精。首先测量每头公猪精液的密度、活力及精液总量，利用公式计算出每头猪精需要加入的A液、B液的量。并且做好详细记录，将数据输入电子表格待用。将2.4毫升生理盐水注入比色皿中，再取100微升的新鲜猪精液注入混合、摇匀，用猪精密度仪测试密度。

再将每头猪的精液均匀分装到45毫升专用离心管中，拧紧盖子，做好每管猪精的编号记录，确保精液不混淆，放到高速离心机中进行离心。离心机内的工作温度是6～8℃、离心转速2500转/分钟、15分钟/批。待鲜精离心结束后将离心管全部取出，把每个离心管的上清液倒掉，剩下最后沉底的精子团，再用100微升移液枪将多余的上清液去掉。然后按照之前的计算量先加A液，摇匀，然后用移液枪吸取全部精液，最后逐一分类、归拢。

三、猪精的平衡与分装

将每管已经加了A液的猪精和B液一起在17℃的水温中水浴。转移到4℃的实验室专用恒温冰箱内静置3～4小时。此时实验室的工作温度要求在18～23℃为宜。经过3～4小时的静置平衡后，将A液和B液取出，转移到4℃条件下的平衡操作柜中进行等温加液。对照精液记录信息，按提示量相应地加入B液。混合均匀后立即进行精液分装工作。采用0.25毫升容量的细管，使用法国卡苏公司生产的IS4全自动精液灌装一体机和多米诺A系列喷码机，联合灌装成产品。制作要求：每支细管0.25毫升精液，有效精液量为0.18～0.23毫升的为合格产品。每支细管总精子数是1亿，有效精子数是2500万。将分装好的细管精液排好，放到专用架子上，记录支数。再把细管精液放置到4℃的恒温柜中静置5～10分钟。

四、猪精的冷冻制作

打开法国IMV冷冻仪设备，选择猪精冷冻程序，启动冷冻仪。开启液氮阀门，检查液氮压力。当冷冻程序提示冷冻柜达到4℃时迅速打开冷冻柜门，将平衡好的细管精液放入冷冻柜的相应架子上，关门稍等1分钟，待冷冻柜内部温度稳定后点击开始制冻。约7分钟后即可完成冷冻过程。从冷冻柜内取出细管精液，迅速浸泡到液氮中，这时产品制作完成。

五、猪冷冻精液的解冻与活率观察

将恒温水浴锅调节至39℃，另外插入一支水银温度计测量实际温度。将指型管排成一排放置于架子上，浸泡到水浴锅中。每支指型管分别加入1～2毫升的猪冻精解冻液，待用。从液氮中取出一支冷冻精液，在空气中晃动1秒，然后迅速、完全浸泡到水浴锅中，摇晃解冻30秒以上。取出解冻后的冻精，用纸巾擦干表面水分，将细管封口端剪掉1厘米，把整支细管的精液全部挤到指型管内，摇匀。用移液枪取10微升，滴注于载玻片上，盖上盖玻片，置于电子显微镜恒温板上观察，要求观察不同的视野，综合评定解冻后的精子活力，活率在0.35以上的为合格产品。

六、小结

为了制作出质量好的猪冻精，主要注意以下几点：

1.精液采集过程中必须要做到消毒、卫生，防止异物和杂质混入精液中。在采精杯杯口装上精液过滤纸。

2.采精过程中根据公猪射精特点，不要前段精清部分，只要中段射精浓的部分，后段排空不要，保证精液浓度符合制作冻精的标准。

3.猪精采集结束后，要求在等温情况下尽快把猪精与原精稀释液混合均匀，然后放置于保温箱内保存，并尽快送到实验室，防止猪精环境温度变化过大，影响活力。

4.猪精平衡后加B液，必须要在4℃的恒温平衡柜内操作，此时实验室环境温度控制在18～23℃，让猪精在加液和分装过程中始终保持在低温环境下，减少温差变化对精子的影响。

5.尽管全州东山猪的精液比较耐冻，解冻后成活率高，但想获得质量更好、浓度更高的原精，必须每天给公猪增加蛋白营养，如精饲料、鸡蛋等。建议公猪每隔3～4天采精1次为宜。切勿频繁，造成公猪机能损伤。

6.公猪精液从采集出来、稀释、加液、平衡，再到进入冷冻阶段，始终保持逐级降温的方式，防止回温。只有这样才能制作出优质的猪冻精。

7.东山猪冻精的最佳解冻温度是39～39.5℃。将解冻后的整支精液完全挤入解冻液中混匀，取10微升精液，在镜检观察后综合评定打分。如果取精液量太多，会出现精子堆集、分层、密度过大等问题，不利于判断精子活率和解冻效果。