不同甘蓝类蔬菜材料对根肿病的抗性鉴定及分子标记辅助选择

蒋顺顺 刘才铭 赵 宇 胡文惠 吴嘉炳 李勤菲 任雪松 宋洪元 司 军

（西南大学园艺园林学院，重庆市蔬菜学重点实验室，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆 400715）

根肿病是由芸薹根肿菌（Woron.）侵染引起的土传性病害，主要在十字花科植物之间传播，被侵染的植株根部会出现肿瘤，十字花科植物都有被侵染的可能（彭琦 等，2019）。根肿病最早发现于地中海西岸和欧洲南部，目前全世界均有分布（费维新 等，2016）。我国20 多个省、市、自治区均有十字花科蔬菜根肿病发生，西南地区和中部地区发病最为严重，一般产量损失20%～30%（张红 等，2021）。近年来，随着蔬菜种植面积逐年扩大，商品种子的相互调运，致使我国蔬菜根肿病的发病面积逐年扩大，严重危害了十字花科蔬菜生产（王靖 等，2011）。植株被根肿菌侵染后，根部肿大，阻碍水分和营养物质的运输导致地上部分枯萎，严重时可导致全株死亡（伍文宪 等，2015）。根肿菌的休眠孢子在土壤中可以存活十余年之久，并且可以借由农事活动或以风、水为媒介进行传播（马淑青 等，2006）。在众多根肿病防治措施中，选育抗病品种是最经济有效的措施，因此现在全球范围内都在大力开展抗根肿病育种工作。但由于甘蓝类蔬菜抗根肿病资源比较缺乏，且根肿菌生理小种较多，因此抗根肿病育种进程缓慢。

对育种材料进行抗性鉴定是抗病育种的基础，张小丽等（2016）对446 份青花菜材料进行根肿病抗性鉴定，其中1.12%表现为抗病。黄蓉等（2019）对291 个油菜品种进行根肿病抗性鉴定，其中9 号生理小种侵染的所有品种均未感病，4 号生理小种侵染的有5.26%的品种表现抗病。司军等（2009）对19 份甘蓝材料进行根肿病抗性鉴定，筛选到3 份抗病材料。甘彩霞等（2017）对100 份萝卜种质进行根肿病抗性鉴定，抗病种质占13%，包括8 份白皮萝卜、3 份红皮萝卜和2 份绿皮萝卜。在根肿病抗性鉴定的过程中，为了保证发病情况稳定一致，通常采取人工接种的方法进行鉴定，目前普遍采用的人工接种方法有菌土法（司军 等，2003）、蘸根法（Johnston，1968）和灌根法（朱红芳 等，2016）。菌土法和蘸根法操作较为繁琐、耗时，不适合大量材料的筛选鉴定；灌根法操作简便，发病稳定，被广泛应用于根肿病抗性鉴定。

利用根肿病抗性基因进行新品种选育是抗根肿病育种必不可少的工作内容。目前已经报道了8 个大白菜上的根肿病抗性基因，分别为、、、、、、和，这些基因都已被定位在大白菜染色体上，且均为单基因显性 遗 传（Suwabe et al.，2003；Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008）。Kato 等（2013）研究表明，位于标记KB59N07 和B1005之间的CRb基因与SSR 标记B0902 紧密连锁，从而能够辅助选择十字花科作物对根肿病的抗性。西南大学十字花科蔬菜研究所根据先正达（中国）投资有限公司专利公布的与甘蓝根肿病抗性基因相关的RAPD 标记，进行PCR 扩增，对特异条带进行回收、克隆后，成功将RAPD 标记转化为SCAR 标记（OA）（何海艳，2018），并利用SCAR标记对不同抗、感根肿病甘蓝材料进行分子标记鉴定，与人工接种根肿病抗性鉴定结果表现一致（宋莹 等，2019）。因此，可以利用人工接种抗性鉴定结合分子标记辅助选择增强对根肿病抗性鉴定结果的准确性。

本试验采用灌根法人工接种根肿菌4 号生理小种，对西南大学十字花科蔬菜研究所提供的29 份甘蓝类蔬菜材料进行根肿病抗性鉴定；并利用SSR标记（B0902）和SCAR 标记（OA）进行分子标记辅助选择，验证人工接种抗病性鉴定的准确性。旨在筛选抗病和耐病的甘蓝类蔬菜材料，为十字花科蔬菜抗根肿病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试29 份甘蓝类蔬菜材料由西南大学十字花科蔬菜研究所提供，其种类、熟性、来源及育性详见表1；以西园4 号为感病对照。

表1 供试甘蓝类蔬菜材料的种类、熟性、来源及育性

供试根肿菌采集于重庆市武隆区发病的甘蓝肿根，经Williams 鉴别系统鉴定为4 号生理小种；用自来水把甘蓝肿根表面杂质清洗干净，于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 人工接种抗病性鉴定

1.2.1 菌液的制备 取备用甘蓝肿根40 g，加去离子水200 mL，搅拌机捣碎后用3 层纱布过滤，将滤液稀释至1 000 mL；取1 mL 孢子悬浮液，稀释10 倍，用血球计数板统计休眠孢子浓度，将休眠孢子悬浮液稀释至2 × 10个·mL，4 ℃冰箱保存备用（张红 等，2016）。

1.2.2 接种 2020 年10 月5 日，将29 份甘蓝类蔬菜材料及感病对照在西南大学温室内分别播种，采用50 孔穴盘基质（草炭∶蛭石∶珍珠岩=2∶1∶1）育苗；播种后每3 d 浇1 次水，出苗14 d后进行间苗；之后每2 d 浇1 次水，每7 d 喷施2次营养液，温室内温度保持25 ℃左右；3 次重复，每重复10 株。10 月26 日、幼苗两叶一心时，将制备好的根肿菌休眠孢子悬浮液稀释5 倍，用移液枪吸取根肿菌休眠孢子悬浮液5 mL，注射在幼苗根部；之后正常管理，注意预防蚜虫、白粉虱等虫害，阴雨连绵天气适当补充光照。

1.2.3 根肿病病情调查 接种42 d 后调查根肿病发病情况。根肿病分级标准采用陈静等（2016）的方法：0 级，根系生长正常，无肿瘤；1 级，主根不发病，部分侧根或须根上有较小肿瘤；2 级，主根发病较轻，轻微膨大，部分侧根或须根有肿瘤，或者主根不发病，较多侧根或须根有明显肿瘤；3 级，主根发病较重，异常膨大、龟裂，有明显侧根或须根；4 级，根系几乎无侧根或须根，主根异常膨大、龟裂或者腐烂。

发病率=（发病株数/调查总株数）× 100%

病情指数（DI）=Σ（各级病株数×相应级值）／（调查总株数×最高级值）× 100

群体抗性分级标准采用司军等（2003）的方法：免疫（I），病情指数=0；高抗（HR），0 ＜病情指数≤5；抗病（R），5 ＜病情指数≤20；耐病（T），20 ＜病情指数≤30；感病（S），病情指数＞30。

1.3 分子标记鉴定

1.3.1 DNA 的提取 采集人工接种抗病性鉴定表现抗病和耐病的甘蓝类蔬菜材料的幼嫩叶片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法（Murray &Thompson，1980）提取单株DNA 作为模板进行PCR 反应，利用Nanodrop 2000 分光光度计测定DNA 浓度。

1.3.2 琼脂糖凝胶电泳 本试验采用的SCAR 标记引物为OA（何海艳，2018），其引物序列见表2。PCR 反应体系为25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最 后加ddHO 补齐至25 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，7 个循环；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，22 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 本试验采用的SSR 标记引物为B0902（沈舒，2019），其引物序列见表2。PCR 反应体系为25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最后加ddHO 补齐至25 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

表2 OA 和B0902 引物序列

2 结果与分析

2.1 人工接种抗病性鉴定

从表3 可以看出，感病对照西园4 号100%发病，病情指数为67.71，抗性分级为感病，说明本试验采用的接种方法准确可靠。参试的29 份材料中，Cr7 表现免疫，绿抗9 号和青莲甘蓝表现高抗，S148、Cr5、Cr6 表现抗病，S146 和S296 表现耐病，其余材料表现为感病。

表3 29 份甘蓝类蔬菜材料人工接种抗病性鉴定结果

2.2 分子标记鉴定

对人工接种抗病性鉴定表现免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘蓝类蔬菜材料进行分子标记鉴定。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1 所示，Cr5、绿抗9 号、青莲甘蓝、S296 等4 份材料扩增出大小为500 bp 的特异条带，而Cr6、Cr7、S148、S146没有扩增出特异条带。由此可以判断Cr5、绿抗9号、青莲甘蓝、S296 携带抗病基因。

图1 OA 对8 份甘蓝类蔬菜材料的PCR 扩增结果

聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2 所示，8 份材料都扩增出大小为180 bp 的特异条带，由此可以判断这8 份材料都携带抗病基因CRb。

图2 B0902 对8 份甘蓝类蔬菜材料的PCR 扩增结果

3 结论与讨论

十字花科植物的根肿病危害近年来呈扩大趋势，然而目前甘蓝类蔬菜抗病资源缺乏，在根肿病防控方面，传统的化学、生物和农业防治措施效果欠佳。因此，选育抗根肿病品种是最有效的途径，而筛选鉴定抗病材料是抗病育种的基础。肖崇刚和郭向华（2002）、孙超等（2016）通过苗期人工接种抗性鉴定，筛选出不同抗性的甘蓝材料，可应用到抗病育种中。本试验从29 份甘蓝类蔬菜材料中筛选出8 份抗根肿病材料，为甘蓝类蔬菜抗根肿病育种奠定了基础。

甘蓝类蔬菜抗根肿病材料的人工接种鉴定易受环境影响、费时费力，选择准确性不够高，采取分子标记辅助选择可大大减少鉴定的工作量，明显缩短育种进程，加快新品种选育。战宗祥等（2015）运用分子标记辅助选择成功选育了具有根肿病抗性的甘蓝型油菜新品种华双5 号；李倩等（2021）利用分子标记辅助选择培育了抗根肿病甘蓝型油菜新品种华油杂62R；徐学忠等（2015）利用分子标记辅助选择培育了抗根肿病大白菜新品种CCR11242。在十字花科作物抗根肿病育种中，利用分子标记辅助选择多在甘蓝型油菜和大白菜中应用，在甘蓝中报道较少，这与根肿病抗性基因多存在于芜菁和大白菜中有关。本试验利用SCAR 标记（OA）与SSR 标记（B0902）对表现免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘蓝类蔬菜材料进行分子标记辅助选择，结果表明4 份材料含有基因，8 份材料含有CRb基因，其中Cr5、绿抗9 号、青莲甘蓝、S296 含有基因和CRb基因2 个抗性位点，可将这4 份材料直接应用到甘蓝抗根肿病育种中，而Cr5、绿抗9 号、青莲甘蓝是雄性不育材料，需要利用专用恢复系进行育性恢复，然后再应用到抗病育种中（Li et al.，2021）。