狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎的研究进展

2022-04-25 12:57陈晓婷孙士正武有聪

中国人兽共患病学报 2022年4期

陈晓婷，乾莲，孙士正，武有聪

营自由生活的阿米巴(free-living amoeba, FLA)多为机会致病性阿米巴，主要包括棘阿米巴、耐格里属阿米巴及狒狒巴拉姆希阿米巴[1]。狒狒巴拉姆希阿米巴(BalamuthiamandrillarisAmoeba)以前被称为Leptomyxidamoeba，最初是从圣地亚哥动物园一只死于脑膜脑炎的狒狒大脑中分离出来的[2]，是在基于与棘阿米巴形态学、生理学和抗原不同而新确立的属和种，引起人类感染多以皮肤损害为首发症状，亦可表现为亚急性或慢性中枢神经系统感染的肉芽肿性阿米巴脑炎(granulomatous amebic encephalitis, GAE)，暴发性的原发性阿米巴性脑膜脑炎(primary amebic meningoencephalitis, PAM)较罕见[3]。此外，该病原体还可引起多种动物，如猩猩、蝙蝠、马、狗等的狒狒巴拉姆希阿米巴相关感染[4-6]。除了直接引起人类疾病外，FLA有利于病原菌生存、繁殖和定居的生态系统，从而在FLA感染宿主方面发挥重要作用，FLA还可以容纳细胞内的致病和非致病微生物，并可能成为人类细菌和病毒感染的宿主和媒介。

目前，有关狒狒巴拉姆希阿米巴的流行病学数据有限，狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎的发病机制及临床表现尚不清楚，其病情进展快、误诊率高，病死率高，因此，早期诊断、尽早治疗显得尤为重要[7]。本文从狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎的病原学、临床表现、诊断及防治原则等方面进行综述，为狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎的防治提供参考。

1 病原学

1.1 生活史狒狒巴拉姆希阿米巴同棘阿米巴相似，也存在两个生命周期阶段：滋养体和包囊[8]。当环境适宜，利于生长时，滋养体为狒狒巴拉姆希阿米巴的感染期；而当环境不利时，滋养体可变为包囊，处于静止期或慢性感染阶段[9-10]。滋养体多呈圆形或卵圆形，直径约为12～60 μm，通常表现为单核(偶见双核形式)和多形性，其特征是胞核内含有密集的核仁，部分胞核含有分裂或多重核仁，胞质内含有线粒体和囊泡，其中一些囊泡中含有颗粒。这些特征在组织切片中被用来区分狒狒巴拉姆希阿米巴和棘阿米巴[11]。滋养体有明显的伪足，可进行缓慢的运动，当出现手指状伪足时，可表现为蜘蛛状的行走特征[9]。包囊多为球形单核，直径约为12～30 μm，由厚厚的内层、不规则的外层和中间的无定形层3部分组成，但在光学显微镜下仅观察到圆形坚硬的内层和波浪形外层的双层壁，胞质中有致密的囊泡和透明的空泡，并有许多颗粒。滋养体和包囊形态都是具有特征性的核形态，并倾向于聚集在血管或坏死组织周围，可导致典型的中枢神经系统血管病变[11]。有时，滋养体可在血管或坏死组织周围形成环状结构。由于滋养体的形态结构与周围组织细胞十分相似，这使得此病的漏诊率及误诊率大大增加[12]。

1.2 线粒体结构狒狒巴拉姆希阿米巴(B.mandrillarisstrain 2046)线粒体基因组包含2个核糖体RNA(rRNA)基因、18个转运RNA(tRNA)基因和38个编码序列，且含有5个假设蛋白。系统发育分析表明，自然界中至少存在3个独立的狒狒巴拉姆希阿米巴谱系，推测内含子是线粒体基因组之间变异的主要来源。线粒体RPS3基因的ORF可能含有一个RPS3内含子或基因间隔区，使用保守的外部引物对该位点进行验证性PCR和测序，结果显示每个被测菌株都有独特的长度和序列。因此，该位点可应用于阿米巴区域检测和基因分型[13]。

2 流行病学

2.1 传染源淡水[14-15]、土壤[16-18]和灰尘中存在的狒狒巴拉姆希阿米巴是主要的传染源，已从不同国家的水源和土壤中分离出狒狒巴拉姆希阿米巴滋养体或包囊，但由于狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎的潜伏期较长，尚无法确定准确的传染源[9]。流行病学资料显示，从事园艺、庭院工作或娱乐、农业和牧场等土壤暴露工作者是狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎的高危人群，仍具较高患病风险，这与土壤暴露假说相一致[3]。

研究表明，狒狒巴拉姆希阿米巴相关感染者的器官供体亦具有供体源性感染风险，可导致多名受者发生严重的狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎，经治疗后，轻者可能会有轻微的认知障碍和偏瘫，不能单独从事工作，重者则无法存活；仅少数器官移植受者未产生明显异常症状[19]。另外，器官移植后的狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎患者的病程进展较自然感染情况(几个月到几年)要快得多，提示器官移植受者接受免疫抑制治疗可能增加患病风险[20]。

2.2 传播途径狒狒巴拉姆希阿米巴可直接通过污染破损的皮肤而感染，或经鼻或口吸入包囊，继而经鼻/嗅神经、肺、皮肤和胃肠道等多种途径进入人体引起相关部位的感染，亦可通过器官移植等血源性传播引起感染。多种传播途径最终导致狒狒巴拉姆希阿米巴播散至中枢神经系统，引起狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎(BalamuthiamandrillarisAmoebicEncephalitis，BAE)[21]。

2.3 易感人群狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎几乎发生于所有年龄段的患者,患病年龄从4个月至91岁分散不均，并未表现出极端的年龄特异性[3]。该病在人群中呈无差别感染，但有酗酒和吸食可卡因的病史，肿瘤或慢性疾病导致的免疫力低下(如患乳腺癌、糖尿病及皮肤病变等)可能会增加感染BAE或加速BAE病程的风险，并且免疫力低下人群在后期治疗中疗效相对较差[11,22-23]。研究表明巨噬细胞对体外狒狒巴拉姆希阿米巴无抑制作用，这可以解释，狒狒巴拉姆希阿米巴在免疫功能正常或免疫功能低下人群中均可引起感染[24]。同时，男性比女性更容易患BAE，可能因为男性往往比女性更需要暴露于户外活动中，增加了土壤源感染风险，尤其是皮肤有破损者[3，21]。器官移植中受者发生狒狒巴拉姆希阿米巴感染为该病的血源途径传播提供了确凿证据，移植受者观察潜伏期多为17～24 d，一般具有快速的临床病程，给予移植受者的免疫抑制疗法可能增加患病机会或加快病程[19]。另外，大量使用广谱抗生素也是该病的重要危险因素之一[25]。

2.4 流行区狒狒巴拉姆希阿米巴患者广泛分布于除非洲和南极洲以外的五大洲中，大多数病例发生于炎热干燥的热带或亚热带气候地区，主要包括处于温暖气候的美国及南美洲地区，特别是来自拉美裔或西班牙裔种族人群，推测炎热干燥的环境比较适合狒狒巴拉姆希阿米巴的繁衍[9,19,26]，见图1。但需要注意的是，该病发生与季节变化无关，一年四季均有发生，无季节特异性。有研究表明，虽然非洲地区尚未发现人群感染病例，但在部分西非志愿者血清中发现了狒狒巴拉姆希阿米巴的抗体[27]，并在几内亚的井水中发现狒狒巴拉姆希阿米巴阳性样本[14]。所以不排除部分发展中国家由于不完善的公共卫生条件和较落后的医疗设施等因素导致非洲及其他地区的误诊或漏诊，出现部分区域无病例报告的情况。此外，一项有关狒狒巴拉姆希阿米巴土壤基因搜寻的研究表明，狒狒巴拉姆希阿米巴有能力传播到更广阔的气候区，甚至是在暴风雪地区[18]。据文献报道，美洲地区发现病例较多，推测阿米巴生存需要适宜气候，并从美国的国际领养人条例及移民史可推测非洲及其他地区也可能存在狒狒巴拉姆希阿米巴病原体，并有机会携带至其他地区，但由于该病多由自然环境来源获得，并且在美国各地自然存在，因此，人际传播感染可能性较低[28]。

2.5 狒狒巴拉姆希阿米巴在中国的流行现状(表1)

据报道[12,33-34,56-57]，目前中国境内共有32名感染狒狒巴拉姆希阿米巴患者，见图2。其中，男性20名(62.5%)，女性12名(37.5%)，患者年龄从2岁至74岁不等(平均26.5岁)；17例(53%)是儿童(年龄<18岁)。病例分布于中国14个省，其中29名患者(91%)来自农村地区，3名患者居住于城市。12名(37.5%)患者仅有皮损症状，经治疗后，痊愈出院；18名(56.25%)患者皮损后进展为脑炎，治疗无效死亡；1名患者反复发热，治疗无效死亡；另1名患者仅出现皮损症状，无随访记录。

32名患者大多不均分布于农村地区且男性患者居多，提示接触土壤或受污染的水源或器具所导致的皮损外伤，可能是狒狒巴拉姆希阿米巴感染的病因。患者年龄和免疫特征并未过多影响疾病的感染，但免疫力过低及患有慢性疾病患者可能更容易患BAE或加速BAE病程进展。

狒狒巴拉姆希阿米巴感染可表现为多种临床类型，如皮肤病变、鼻咽或鼻窦感染，或包括脑炎在内的播散性感染[54]，主要通过影响皮肤和中枢神经系统[33]，但中枢神经感染的临床症状并不典型，易与脑囊虫病、脓肿、空洞病变、肿瘤和急性播散性脑脊髓炎等疾病相混淆，尤其需要与棘阿米巴脑炎作出鉴别[10]。疾病首发多以皮肤病变为主，这与秘鲁患者病症相似，但皮肤病变通常是单一的，周围偶尔有卫星病变，皮肤损伤多表现为面部或四肢中心(特别是膝盖)的无痛性斑块或溃疡[3]，经林可霉素和阿奇霉素等药可治愈。若后期进展为脑炎症状，如发热、

图1 全球狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎流行现状Fig.1 Global distribution of Balamuthia mandrillaris amoebic encephalitis

头痛、呕吐、易怒和嗜睡[34]，而最常见的神经系统特征是精神状态改变，癫痫发作和虚弱无力，部分患者偶尔伴有肺炎、支气管肺炎、肝功能衰竭、肾功能衰竭或严重的多器官功能衰竭[21]，加大治疗难度，病程进展极快，死亡率较高。研究表明，皮肤损害和肺部感染可能持续数月甚至数年之久，但中枢神经系统感染却可能在几天时间内导致患者死亡[12,58]。

狒狒巴拉姆希阿米巴感染可通过免疫组织化学检查、组织细胞培养、PCR检测以及脑脊液二代测序等方法进行确诊，其中，二代测序结果较为迅速且准确，如出现皮损伴有不明原因的中枢神经系统症状的患者，建议采用测序法筛查是否存在狒狒巴拉姆希阿米巴病原体，以便于早期诊断，尽早治疗，降低患者病死率。

3 诊断与鉴别诊断

3.1 一般检查大多数狒狒巴拉姆希阿米巴脑炎患者的血白细胞(WBC)计数均轻度升高，并以淋巴细胞为主，一般脑脊液(CSF)检测很难发现阿米巴病原体，但部分CSF 标本的IL-6和IL-8水平显著升高，并显示葡萄糖水平正常或略低，蛋白质水平升高，而高水平的IL-6等细胞因子可能对该病原体穿越血脑屏障或启动炎症早期反应起关键作用[9,33]。几乎狒狒巴拉姆希阿米巴性脑炎患者均显示异常脑成像,一般表现为实质性病变，但通常是非特异性的，容易误诊为急性播散性脑脊髓炎等疾病[3]，而神经影像学检查通常显示多发斑片状病灶，在弥散加权成像上表现为高信号，在T1加权成像上表现为环形强化，具有早期诊断的价值。BAE的非特异性临床特征可能是导致大多数患者延迟诊断的一个重要因素。

可针对血清样品进行ELISA筛选，对非器官移植受者ELISA阳性和可疑的标本进行免疫荧光分析(IFA)确证检测，当检测滴度≥1∶64时，可认为是狒狒巴拉姆希阿米巴血清阳性结果[59]，应积极进行抗虫治疗；但器官移植受者若滴度较高，需将其作为假阳性结果，可通过实验性化疗降低滴度。鉴于该法漏检率较高，并非临床常用方法。

3.2 组织培养对于诊断阿米巴性脑炎，最重要的是鉴定组织或脑脊液中的病原体，并进行病理涂片检查或脑脊液的培养。在自然环境中培养狒狒巴拉姆希阿米巴非常困难，它不以细菌为食，可将获取组织中疑似狒狒巴拉姆希阿米巴生物颗粒引入猴肾细胞(E6)、绿猴肾细胞(Vero)及人肺纤维母细胞(HLF)等组织培养细胞中生长，并于RPMI-1640培养基、BM-3液体培养基等含10%胎牛血清的人工培养基或涂有其它阿米巴或哺乳动物细胞作为食物来源的培养基中生长，最适宜的培养温度是30 ℃或37 ℃[9]，以进行形态学观察(滋养体或包囊)[10-60]。

3.3 基因测序二代基因测序(NGS)广泛用于罕见病或新病原感染的辅助诊断[33]，能够快速且同时检测临床样本中的病毒、细菌和真核寄生虫，将提高基于测序的诊断和监测工作的敏感性，并可用于指导基因分型和病原体检测的靶向分析[13]。在阿米巴性脑炎领域，NGS可用于鉴别诊断棘阿米巴、耐格里属阿米巴和狒狒巴拉姆希阿米巴。

通过对患者死亡前后脑脊液和脑活检样本进行宏基因组测序可证实存在狒狒巴拉姆希阿米巴序列，但鉴于部分患者宏基因组测序数据中缺少狒狒巴拉姆希阿米巴18S rRNA的全基因组序列信息，所以在这部分患者入院治疗首日脑脊液标本中18S rRNA PCR检测几乎不可能出现阳性结果，因此，该方法仅可用于检测患者入院治疗1 d后的脑脊液标本[34]。

3.4 分子诊断技术基于狒狒巴拉姆希阿米巴线粒体小亚基rRNA基因(rns)的DNA序列信息可快速鉴定出狒狒巴拉姆希阿米巴[61]。可对来自GenBank RNS登录号AF477012～AF477018的7个狒狒巴拉姆希阿米巴分离株的RNS序列进行比对，筛选出潜在的PCR引物，并设计出5′端的Balspec16S (5′-CGCATGTATGAAGAAGACCA-3′)和3′端的Balspec16S (5′-TTACCTATATAATTGTCGATACCA-3′)，可获得扩增的1 075 bp的PCR产物，并与棘阿米巴及多种寄生虫PCR产物联合鉴别，具有特异性[60-18]。这套引物可高特异性扩增狒狒巴拉姆希阿米巴线粒体DNA序列，但不会扩增出人类 DNA 产物。这种非常敏感的诊断手段未来将应用于存档脑炎样本的回顾性分析和临床标本的筛选，以期在可能的治疗方案中尽早发现感染早期的阿米巴。

3.5 鉴别诊断狒狒巴拉姆希阿米巴与棘阿米巴虽有许多共同之处，但仍有区别。狒狒巴拉姆希阿米巴滋养体核内多有密集的核仁，可出现手指状伪足，表现出蜘蛛状的行走特征，其包囊有3层壁，但光学显微镜下仅观察到内硬外波浪的双层壁；而棘阿米巴仅有1～2个大而致密的核仁，带有细长，矛样足突，其包囊囊壁分内外两层，其汇合处可形成一到多个棘孔，内囊呈环形略有褶皱，外囊呈多角形轮廓。二者培养条件大不相同，棘阿米巴可在播满活的或灭活的大肠杆菌等非营养琼脂中生长，而狒狒巴拉姆希阿米巴只能在猴肾细胞或人纤维母细胞等进行组织培养，培养难度较高。在炎热干燥的热带或亚热带气候地区从事土壤相关工作人群易感狒狒巴拉姆希阿米巴，常表现为皮肤红斑、发热、头痛、呕吐和嗜睡、精神状态改变、癫痫发作和虚弱无力等临床症状，而棘阿米巴感染则无明显地域特点，发达国家病例多与角膜接触镜使用相关，发展中国家多因眼外伤导致，患眼多畏光、充血、流泪，伴有与症状不符的剧烈疼痛，还可导致角膜放射性神经炎及环形浸润性溃疡两个特异性临床特征。

4 治疗

狒狒巴拉姆希阿米巴感染的治疗需要按患者损伤部位靶点用药，若患者仅出现皮损，未侵袭脑部组织，则林可霉素、阿奇霉素、干扰素-γ单独使用或按药效联合使用，病人治愈出院后，多年未复发，具有一定疗效[12]。脑部抗虫治疗失败的主要原因是脑脊液穿透性较差和阿米巴包囊囊壁较厚。因此，新的抗虫药物需要具备杀灭阿米巴的活性，并能以最小的毒性穿过血脑屏障[66]。经研究表明，米替福辛(Miltefosine)[22-65]、戊脒、咪康唑(miconazole)和5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)、酮康唑(ketoconazole)[10]、唑类和大环内酯类[37]、硝基喹啉(Nitroxoline)[67]几种药物单独使用或按药效联合使用在BAE治疗方面具有一定疗效，但这些药的临床疗效和副作用还需要进一步的临床验证。

5 预防措施

由于阿米巴无典型的临床特征，且无明确的治疗方法，因此，临床医生很难进行早期诊断，而误诊和随后可能加重病情的错误治疗，导致全球不到5%的存活率[62]。因此，BAE重在预防。在缺乏淋巴细胞亚群的小鼠中进行的实验性感染表明，CD4+T细胞对于抵抗鼻内狒狒巴拉姆希阿米巴感染和BAE具有重要意义，因此，增强自身免疫至关重要[68]。经常暴露于土壤中可能是狒狒巴拉姆希阿米巴感染的危险因素，因此，加强相关职业人群参加户外活动时的自我防护是预防该病的有效措施。同时，注意提升易感人群的生活质量，可通过周期性检查水箱、淋浴器、空气过滤器以及医疗用水除菌器械等最易潜伏阿米巴的相关系统，降低感染风险[62-6]。

在评估有神经系统体征和症状的潜在捐献者时应更谨慎严苛，在条件允许情况下，应对疑似患者进行脑脊液检查和神经影像学成像分析，以便对患者进行诊断和治疗，并且便于对死亡患者进行风险评估[19,69]。患有脑膜炎症状的捐赠者应该接受脑脊液基本参数(葡萄糖、蛋白质、细胞计数、革兰染色)检测，并由移植中心公布结果。剩余的脑脊液应与供体血清一起存档，以便在疑似供体来源感染的情况下进行检测。而对于器官移植的供者，器官移植中心应进行死后脑脊液和脑组织检查，以利于受者的早期诊断和治疗。同时，建议移植中心存档受者的移植前血清，因为这些标本在确定移植后滴度阳性，在再激活、移植后暴露或供者来源的感染方面起到一定作用。需要及早统计报告受者狒狒巴拉姆希阿米巴感染情况，这将允许快速识别和治疗接受者，并提供有关捐赠者感染和传播给接受者的风险因素的更多信息，有利于今后完善捐赠者的评估。

利益冲突：无