大鼠脑缺血再灌注通过TGF- β1/Smad7通路诱发急性肾损伤的机制探究

刘云，方锦程，钟文华，王林，张艺，洪云，李曙

(1.皖南医学院 病理生理学教研室，安徽 芜湖 241001； 2.皖南医学院弋矶山医院 神经外科，安徽 芜湖 241001； 3.皖南医学院弋矶山医院 超声医学科，安徽 芜湖 241001)

急性脑卒中是临床上较为常见的脑血管疾病，它可以发生在机体器官或组织缺血缺氧过程及缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR) 治疗后[1]。大量研究证明，脑IR可活化炎症细胞，促进炎症介质释放至远端器官，最终引起全身性炎症反应[2- 3]，其中肾脏损伤也较为多见。目前已有研究证明导致脑组织IR损伤的机制有白细胞聚集、自由基生成和细胞内超载等[4- 5]，但对肾脏组织损伤的机制仍缺乏明确的研究结果，导致临床在进行治疗和药物干预时缺乏理论支持，所以脑IR引起的急性肾损伤(AKI)仍然是临床医生面临的一个严峻挑战。造成这种临床现状的一个主要原因是缺乏有效的动物模型，因此本研究希望建立一个稳定、有效、符合临床的脑IR损伤诱发AKI的动物模型，探索其发生机制，为临床治疗这一类急重并发症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选取4～6周龄SPF级健康雄性大鼠，体重240～270 g，由长沙生物天勤有限公司提供，在皖南医学院实验动物中心饲养。动物实验经安徽省动物伦理委员会批准。尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。转化生长因子- β1(TGF- β1)、Smad7 抗体购自博奥森(Bioss)生物技术有限公司(北京)。Q- PCR试剂盒购于诺唯赞(Vazyme)生物科技有限公司(南京)。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠脑缺血模型 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml·100 g-1)麻醉，仰卧位固定后颈部备皮消毒。沿颈正中部切口，钝性分离至暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，将血管与周围的组织钝性分离，用微血管夹夹闭CCA的近心端。在ECA近交叉部位用丝线打一活结，远心端打结，之间剪开缺口插入线拴，固定活结，调整方向插至大脑中动脉分叉处，松除微血管动脉夹，此时大鼠大脑中动脉处于闭塞状态。将20只大鼠随机分为正常组和缺血2、4、6 h组4组各5只。闭塞时间达到实验所需时间时观察各组大鼠行为学表现，当大鼠出现跛行、转圈或偏瘫即为模型构建成功。此时将大鼠处死，通过肾功能及病理学观察选出损伤较为严重的时间点作为IR模型中的缺血时间点。之后取25只大鼠构建该缺血模型，并随机分为再灌注3、6、12、24、48 h 5组。根据分组时间点取出栓子并处死大鼠。

1.2.2 生化指标及肾脏质量指数检测 大鼠麻醉后腹主动脉取血，常温下以3 000 r·min-1离心10 min后获取血清。检测血清BUN和Scr水平。大鼠处死后剥离左侧肾脏称取质量，肾脏质量与处死前大鼠体重之比即为大鼠的肾脏质量指数。

1.2.3 肾脏病理学观察 大鼠处死后取出脑组织和肾组织，冲洗后用4%多聚甲醛浸泡固定48 h。依次脱水、石蜡包埋，常规HE染色和Masson染色。HE染色后镜下观察肾脏病理改变，Masson染色评估肾脏组织胶原沉积情况。

1.2.4 ELISA法检测大鼠血浆炎症因子肿瘤坏死因子- α(TNF- α)和白细胞介素6(IL- 6)水平变化 按照ELISA试剂盒说明书提取大鼠血浆，根据说明书准备标准品、样本、抗体和酶试剂，加入样本和抗体等温育后洗涤，再依次加入显色液和终止液，并立即在酶标仪波长450 nm和630 nm处检测吸光度(OD)值，用标准品的浓度和OD计算出标准曲线方程，再计算样本浓度。

1.2.5 定量PCR检测mRNA表达水平 取肾脏组织皮质区加入1 ml Trizol充分裂解，依次加氯仿、异丙醇、75%乙醇提取RNA，逆转录后得到cDNA。反应体系为：SYBR 10 μl，无RNA酶水7.2 μl，引物上、下游各 0.4 μl，cDNA 2 μl。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。β- 肌动蛋白(β- actin)为对应内参，采用 2-ΔΔCt计算出目的基因相对表达量。引物序列如下:TGF- β1正向5′- TGCGCTTGCAGAGATTAAAA- 3′,反向5′- AGCCCTGTATTCCGTCTCCT- 3′；Smad7正向5′- CAGATTCCCAACTTCTTCTG- 3′，反向5′- GTTGAAGATGACCTCCAGCC- 3′；胶原蛋白Ⅰ正向5′- AGCACGTCTGGTTTGGAGAG- 3′，反向5′- GACATTAGGCGCAGGAAGGT- 3′；胶原蛋白Ⅲ正向5′- ACGTAAGCACTGGTGGACAG- 3′，反向5′- CAGGAGGGCCATAGCTGAAC- 3′；β- actin正向5′- GCGCAAGTACTCTGTGTGGA- 3′，反向5′- AGGGTGTAAAACGCAGCTCAG- 3′。

1.2.6 蛋白质印迹实验 常规提取肾脏组织皮质区总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；同体积的样本加入十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离蛋白后，半干法转膜；5%脱脂奶粉封闭1.5 h后加入一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，二抗(1∶10 000)室温孵育1 h后用ECL法显色。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同缺血时间血清BUN和Scr水平比较及肾脏组织病理学变化

血清BUN和Scr水平正常组在正常范围内，缺血4 h和6 h组较正常组和缺血2 h组显著升高(P<0.05)，缺血4 h组与缺血6 h组相比差异无统计学意义，见表1；缺血4 h和6 h时肾脏质量指数较其他组显著下降。上述结果提示，肾脏功能在缺血4 h时开始出现明显改变。

表1 4组大鼠血清BUN和Scr水平比较 mmol·L-1

大鼠肾脏组织切片HE染色结果：正常组和缺血2 h 组肾小球形态规则，肾小囊整齐紧密排列，肾小管无变形，结构完整；缺血4 h和6 h组可见肾脏肾小球血管袢增生，肾小管轻度水肿扩张，部分区域结构受损。见图1。上述结果说明脑组织缺血时间与AKI密切相关，缺血时间越长肾脏损伤相对越重。

图1 各组大鼠肾脏组织HE染色结果 染色视野均取自肾组织皮质区。A、B、C、D的上图为×200，标尺100 μm； 下图为×400，标尺50 μm

因缺血4 h可见明显肾脏质量指数和肾功能改变，且HE染色可见明显病理改变，故选定缺血4 h为本研究缺血时间。

2.2 不同再灌注时间脑组织病理学变化

在缺血4 h基础上，将再灌注时间点分别设为再灌注3、6、12、24及48 h。脑组织HE染色结果：正常组脑组织结构正常，神经细胞排列整齐，胞质丰富，核仁清晰可见；缺血/再灌注组损伤侧淡染，皮质区胶质纤维溶解、呈筛网状改变，部分缺血边缘区可见液化性坏死，局部可见散在的红细胞和炎症细胞浸润。见图2。上述结果提示脑IR模型构建成功，可进一步行肾脏组织HE染色。

图2 各组大鼠脑组织HE染色结果 A～G的上图为整个脑组织视交叉后2～3 mm切片，标尺2.5 mm； 下图为×200，标尺100 μm

2.3 脑缺血再灌注各时间点肾组织结构变化

肾脏组织HE染色显示，正常组肾脏组织结构完好。缺血4 h/再灌注3 h、缺血4 h/再灌注6 h及缺血4 h/再灌注12 h组均有轻度损伤。但缺血4 h/再灌注24 h和缺血4 h/再灌注48 h组损伤较重，可见肾脏结构分布错乱，部分肾脏皮质片段呈点片状坏死，出现小管上皮细胞萎缩，小管管腔扩张，且伴有局部炎症细胞浸润。见图3。

图3 各组大鼠肾脏组织HE染色结果 A～G的上图为肾组织横切面切片，标尺2.5 mm； 下图为×200，标尺100 μm

结合上述脑组织及肾组织染色结果，选择缺血4 h/再灌注24 h作为本次实验模型的时间点。

2.4 脑缺血再灌注各时间点肾组织纤维化改变

Masson染色结果显示，正常组形态正常，结构完整；在缺血4 h/再灌注24 h时可见肾小球周围及肾小管间质有蓝色胶原沉积，间质纤维组织增生明显；其余各组与正常组之间无明显区别。见图4。上述结果说明缺血4 h/再灌注24 h可引起肾脏胶原沉积，导致肾脏纤维化。

图4 各组大鼠肾脏组织胶原、纤维沉积情况 ×200，标尺100 μm

2.5 IR后各时间点炎症因子水平变化

缺血4 h/再灌注24 h与正常组比较，大鼠血浆炎症因子TNF- α和IL- 6水平明显升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠炎症因子TNF- α和IL- 6水平比较 mmol·L-1

2.6 肾脏组织TGF- β1、Smad7及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA表达的变化

如图5所示，与正常组及缺血4 h组相比，缺血4 h/再灌注24 h组TGF- β1及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA表达显著增加(P<0.05)，而Smad7 mRNA表达显著降低(P<0.05)。

a 与正常组比较，P<0.05； b 与正常组比较，P<0.01； c 与缺血4 h组比较，P<0.01

2.7 肾脏组织TGF- β1、Smad7蛋白表达的变化

蛋白质免疫印迹法检测结果如图6所示。与正常组相比，缺血4 h组TGF- β1表达增加(P=0.007)，Smad7

图6 各组大鼠肾脏组织 TGF- β1、Smad7蛋白表达的蛋白质免疫印迹法检测结果

3 讨 论

在临床上可见较多多重器官损伤的病例。机体作为一个整体，一个器官的损伤可以牵动其他器官而产生“综合征”，如肝肾综合征、心肾综合征，此外肺肾综合征和脑肾综合征等也有描述[6- 8]。脑IR被认为不仅会造成脑组织损伤，还会引起远处器官包括肾脏的损伤。有文献报道AKI是急性卒中后的常见并发症，并证明AKI是急性卒中后早期和长期死亡率的独立预测因子[9]。Khatri等[10]观察到，急性缺血性卒中会导致肾功能障碍，并且与住院时间延长和死亡率增高有关。AKI因其较高的死亡率、发病率及昂贵的医疗费用，成为持续性临床问题[11]。AKI可引起肾脏内的炎症反应和细胞凋亡[12]，炎症是AKI进展的主要因素；急性炎症反应的特征是炎症细胞的激活和促炎细胞因子的过度分泌。有研究[13]表明，急性脑损伤可能导致AKI，并引发肾脏炎症级联反应。

表3 缺血及再灌注对大鼠肾组织中TGF- β1、Smad7蛋白表达的影响

在本研究中，检测大鼠脑缺血后肾脏功能的指标和HE染色结果表明，大鼠脑缺血4 h时可见血BUN、Scr明显升高，HE染色见肾小管水肿扩张，并且随着脑缺血时间延长肾脏损伤不断加重。明确缺血时间后，通过HE染色筛选不同再灌注时间点大鼠肾脏的病理改变，可见在缺血4 h/再灌注24 h时出现肾脏组织局部炎症浸润，部分皮质片段呈片状坏死。为了探究脑IR后大鼠肾功能出现损伤的机制，进一步行肾组织的Masson染色，可见在缺血4 h/再灌注24 h时即可出现肾脏皮质区胶原沉积，考虑因肾脏纤维化导致，于是检测经典纤维化通路TGF- β1/Smad7相关因子的分子水平改变[14]。炎症细胞的活化聚集、细胞外基质的合成与沉积，二者共同促进了肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)改变[15]。Smad7蛋白是TGF- β1受体的胞内激酶底物，是该信号通路的重要介导物质。大量实验证明Smad7作为内源性TGF- β1拮抗剂，可竞争结合TGF- β1受体。此外，Smad7还可诱导TGF- β受体1的泛素- 蛋白酶体降解，从而对TGF- β1/Smad7通路产生负性调节作用[16]。在本研究中，TGF- β1在脑组织IR的动物模型中呈高表达，而其负性调节蛋白Smad7在模型中表达降低；与对照组相比，在脑IR组的肾脏切片中发现炎症细胞浸润增加，且伴有胶原纤维沉积。关于TGF- β1/Smad7 通路激活的原因目前少有报道，检测大鼠脑组织IR后血浆中促炎因子表达，可见呈明显的表达上升趋势，也验证了脑IR后对全身炎症反应系统的激活，从而造成远端脏器的损伤[17]。在今后研究中，可针对TGF- β1这一靶点进行调节，有望改善脑IR引起肾脏纤维化的发生发展。

综上所述，大鼠脑缺血4 h/再灌注24 h时，肾脏组织中TGF- β1/Smad7通路激活，TGF- β1表达明显上升，Smad7表达明显下降，胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达明显上升，且肾脏组织染色中可见明显胶原沉积现象，出现肾脏纤维化改变。在后续的研究中可通过调节这一通路以减少炎症细胞浸润、减轻氧化应激对肾脏造成的损伤，从而改善肾脏受损。本研究为脑IR损伤诱发AKI等相关疾病的临床研究提供了实验基础。