miR-192-5p 通过靶向Notch3 减轻顺铂所致的肾小管上皮细胞凋亡

吴汉章，陈 铖，谢彩蝶，吴 琳，毛慧娟*

1南京医科大学第一附属医院肾内科，江苏 南京 210029；2盐城市第一人民医院肾内科，江苏 盐城 224000

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种以肾功能突然下降为特征的临床综合征，其与住院患者的高病死率、远期慢性肾病的进展及其他类型的器官功能障碍密切相关［1-2］。AKI 的主要特点是近端小管上皮细胞损伤和炎症，肾小管上皮细胞的功能障碍在缺血或毒性作用导致AKI的进展中起着关键作用，但其潜在机制尚未完全阐明［3-4］。

Notch 信号是一种高度保守的细胞间通信机制，可调节细胞发育、组织稳态及修复。近年来一系列研究表明Notch 信号是肾脏发育、损伤和修复过程中的关键调节因子［5］。Kavvadas 等［6］在缺血再灌注肾损伤小鼠模型中发现Notch3 异常高表达并证实Notch3 参与了肾脏炎症反应并导致肾小管上皮细胞损伤，靶向Notch3或可为急性肾损伤提供一种新的治疗策略。然而Notch3 在顺铂诱导的肾小管细胞损伤中的作用及其异常高表达的相关机制尚未阐明。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码的非编码单链RNA 分子，其长度约为19～25个核苷酸，它们通过翻译抑制或促进RNA降解来介导靶基因的转录后调控，从而参与各种生理和病理过程［7］。在AKI 的病理过程中，它们通过调节细胞凋亡、程序性死亡、炎症和细胞增殖等在肾脏的损伤和修复中发挥重要作用［8-9］。然而，目前还没有关于miRNA 在顺铂诱导AKI 过程中调控或靶向Notch3的相关研究报道。

因此，本研究拟寻找靶向Nocth3 的潜在miRNA，通过体外培养人肾小管上皮细胞，并转染相关miRNA 类似物（mimics）以探讨相关miRNA 调控及靶向Notch3 在顺铂诱导肾小管上皮细胞凋亡中的作用，以期为防治肾小管坏死及急性肾损伤提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人近端肾小管上皮细胞株（HK-2 细胞，中国典型培养物保藏中心）；胎牛血清（FBS）、DMEM/F12培养基（Gibco公司，美国）；顺铂（Cisplatin，Cis，Sigma公司，美国）；miR-192-5p 类似物（miR-192-5p mimic）及其配对阴性miRNA类似物（negative control miRNA mimic，NC mimic）、miRNA 相 关PCR 引物（茎 环法）、miRNA 转染试剂盒（广州锐博）；TRIzol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；PrimeScriptTM反转录试剂盒、TB Green实时定量PCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）；miRNA反转录试剂盒（茎环法）、miRNA实时定量PCR 试剂盒（南京诺唯赞）；全蛋白提取试剂盒、BCA 法蛋白测定试盒（南京凯基）；Notch3 兔多克隆抗体（Abcam 公司，英国）；Caspase3 和GAPDH 抗体（Proteintech公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

HK-2 细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液于37 ℃5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞生长至70%～80%融合状态时用胰蛋白酶消化传代，接种于6 孔板后待细胞生长至70%～80%融合状态用无血清培养基同步化培养24 h。实验分为：①NC mimic 组（NC）；②NC mimic+Cisplatin组（NC+Cis）；③miR-192-5p mimic 组（OE）；④miR-192-5p mimic+Cisplatin 组（OE+Cis）。分别转染（NC mimic、miR-192-5p mimic，加或不加顺铂20 μmol/L作用24 h后，提取总RNA、总蛋白。

1.2.2 实时荧光定量PCR

按上述步骤干预细胞24 h 后用TRIzol 氯仿-异丙醇法提取细胞总RNA，按照miRNA 反转录说明书进行反转录，合成cDNA，反应体系10 μL，反转录条件：42 ℃2 min，25 ℃5 min，50 ℃15 min，85 ℃5 min。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL，反应条件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40个循环；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。mRNA 实时定量PCR，按照mRNA 反转录说明将RNA 反转录成cDNA，反应条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s。实时荧光定量PCR反应条件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。引物序列：内参β-actin 上游5′-ATGAAATCGCCGCACTG-3′，下 游5′-TGAGCCTCGTCTCCCAC -3′，Notch3 上 游5′ -TCAGGCTCTCACCCTTGG-3′，下游5′-AGTCACTGGCACGGTTGTAG-3′。采用LightCycler96 实时荧光定量PCR 仪（瑞士罗氏公司）。miRNA 以U6 为内参，mRNA 以β-actin 为内参，根据所得Ct 值，运用2-ΔΔCT相对定量法分别计算miRNA 及目的基因mRNA 相对表达量。

1.2.3 Western blot

各组细胞按上述步骤干预24 h后用预冷的RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和蛋白酶抑制剂裂解，提取总蛋白。测定蛋白浓度并配成统一浓度，加入上样缓冲液，沸水加热5～10 min。制备5%浓缩胶和8%、10%分离胶，取30～50 μg 总蛋白行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白分子，300 mA 恒流电转膜，室温下5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，分别加入一抗（Notch3 抗体，1∶1 000；Caspase3抗体，1∶1 000；GAPDH抗体，1∶2 000）后4 ℃过夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）室温摇床孵育1～2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次10 min。电化学发光液（ECL）显色，凝胶成像系统图像扫描，Image J软件行结果分析。

1.2.4 流式细胞仪分析

用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，PBS 洗涤细胞2 次（1 000 r/min，离心5 min），弃去上清，加入500 μL 的Binding Buffer 重悬细胞后加入5 μL Annexin V-FITC 与5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混匀、室温避光反应5～15 min，1 h 内行流式细胞仪检测。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测

带有miR-192-5p 预测结合位点的Notch3 定向缺失突变型（Notch3-MUT）和野生型（Notch3-WT）3′-UTR 的荧光素酶报告载体单独或与miR-192-5p mimic 共转染至293T 细胞中，细胞裂解后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，采用酶标仪检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

所有数据均使用SPSS22.0 软件进行分析。每个实验重复3次，计量数据以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂处理后肾小管上皮细胞Notch3 及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达及细胞凋亡率情况

流式细胞分析示顺铂处理组细胞凋亡率明显升高（图1A）；同时Western blot 结果表明，与正常对照组比较，顺铂处理组Notch3 及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达均显著升高（P＜0.05，图1B）；实时荧光定量PCR 表明，同正常对照组比较，顺铂处理组细胞Notch3 mRNA表达显著上调（P＜0.001，图1C）。既往研究已报道药理性抑制Notch 信号通路可以减轻顺铂诱导的HK-2细胞凋亡［10］，综上提示Notch3或在顺铂所致的小管损伤中也起重要作用。

图1 顺铂处理后HK⁃2细胞Notch3及cleaved⁃caspase 3表达情况Figure 1 The expression of Notch3 and cleaved⁃caspase3 in HK⁃2 cells after cisplatin treatment

2.2 靶向Notch3的潜在miRNA的筛选和检测

使用公共预测平台Targetscan 检索与Notch3的3′-UTR 结合的潜在miRNA。然后，从既往的研究中选取了微阵列测量肾损伤样本中下调的miRNA［11］。两者取交集，从中选取1个miRNA（miR-192-5p）行进一步分析，实时荧光定量PCR 表明，同正常对照组比较，顺铂处理组细胞miR-192-5p表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。

图2 靶向Notch3的潜在miRNA的预测和检测Figure 2 Gene prediction and verification of possible miRNAs targeting to Notch3

2.3 miR-192-5p mimic的转染效率检测

转染24 h 后，实时荧光定量PCR 检测结果显示，与NC mimic组比较，miR-192-5p mimic组肾小管细胞内miR-192-5p 明显升高，差异有统计学意义（P＜0.001，图3A）。

2.4 miR-192-5p 对顺铂所致肾小管上皮细胞Notch3、凋亡相关蛋白cleaved-caspase3 的表达及细胞凋亡率的影响

将miR-192-5p mimic 与NC mimic 分别转染至HK-2 细胞，加或不加顺铂处理24 h 后，实时荧光定量PCR 检测及Western blot 检测结果显示，同为顺铂处理诱导细胞凋亡情况下，与NC+Cis 组比较，过表达miR-192-5p 明显降低了Notch3 mRNA 及蛋白水平（P＜0.01，图3B、C）。同时，过表达miR-192-5p 后肾小管上皮细胞凋亡相关蛋白cleavedcaspase3 表达及细胞凋亡率均明显降低，差异有统计学意义（图3D）。

2.5 miR-192-5p与靶基因Notch3的靶向关系验证

双荧光素酶报告实验检测发现过表达miR-192-5p 可以降低pmiR-Notch3 3′-UTR-WT 的荧光素酶活性，其活性下降39%（P＜0.01），而pmiRNotch3 3′-UTR-Mut 与miR-192-5p mimic 共同转染细胞的荧光素酶活性未见明显变化，以上结果证实了miR-192-5p 与Notch3 之间的直接作用关系（图5）。

图4 miR⁃192⁃5p对顺铂所致细胞凋亡和Notch3表达的影响Figure 4 Effect of miR⁃192⁃5p on cisplatin⁃induced apoptosis and the expression of Notch3

图5 miR⁃192⁃5p与靶基因Notch3的靶向关系验证Figure 5 Verification of the direct interaction between miR⁃192⁃5p and Notch3

3 讨论

凋亡以细胞自杀或程序性死亡的方式参与顺铂所致AKI的发展［4］。据报道，线粒体介导的凋亡信号通路是顺铂诱导的AKI 和细胞损伤的关键机制［12］。作为凋亡的执行酶之一，caspase3 可通过蛋白水解作用分解细胞内的组成蛋白成分，导致细胞最终形成凋亡小体。既往已有研究证实在肾损伤动物模型中，活化的caspase3 表达明显增加［13］。本研究显示过表达miR-192-5p后，顺铂诱导的肾小管上皮细胞活化的caspase3（cleaved-caspase3）表达及细胞凋亡率降低，提示miR-192-5p可对顺铂所致的肾小管细胞凋亡起保护作用。

Notch 受体是高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，包括Notch1、Notch2、Notch3 和Notch4，它们由细胞外结构域（NECD）和细胞内结构域（NICD）组成。Notch 受体的激活是由NECD 与典型的Notch 配体相互作用引起的，这些配体也是跨膜蛋白，包括Jagged1、Jagged2、dll1、dll3 和dll4。与Notch 配体的结合导致Notch 的切割和NICD 的释放，然后NICD转移到细胞核，与CSL 转录因子相互作用，并启动Notch靶基因的转录从而发挥生物学效应［14］。

关于Notch 信号在肾脏病理中的研究多集中于肾小球疾病及肾纤维化，已有研究大多集中于Notch1。Notch3 是最近才研究增多的一种肾脏疾病介质。正常情况下，Notch3 主要在血管平滑肌细胞中表达。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）和肾毒性血清肾病动物模型中表明Notch3 由受累肾实质细胞重新表达，并发挥了促进肾脏疾病进展的有害作用［15-16］。最近Kavvadas等［6］发现在小鼠缺血再灌注肾损伤（ischemia-reperfusion injury，I/R）模型中，肾小管过表达Notch3，肾小管上皮细胞Notch3 特异性敲除小鼠中则显示较轻的肾损伤及保留的肾功能，肾小管损伤及炎症浸润均有所改善。而Notch3 信号激活的小鼠则在I/R和UUO后对肾脏损伤有较高的易感性，炎症反应及肾小管损伤加重［6］。本研究通过体外培养人肾小管上皮细胞证实，在顺铂毒性作用下，HK-2 细胞中Notch3异常高表达，而抑制Notch3高表达则能够减轻肾小管上皮细胞凋亡。

越来越多的证据表明，miRNA 在AKI 中起着重要的作用。miRNA 水平异常可能是肾损伤发生和发展过程中蛋白质表达异常的原因之一［9］。多种miRNA 及其相应靶基因在肾损伤或修复中发挥的作用已被研究所证实，这些发现表明miRNA 是AKI的关键调节因子及潜在的治疗靶点［8，11］。

本研究先期预测了可能与Notch3 的3′-UTR 结合的miRNA，并与已报道的AKI 中下调的miRNA取交集，从而得出11 个潜在miRNA。进一步发现miR-192-5p在肾损伤活检样本中表达大幅下调（约6 倍），此外也有研究报道在I/R 和顺铂诱导的大鼠肾损伤模型尿液中miR-192-5p 表达大幅增高［17-18］。近来Zou等［19］也报道药物上调miR-192-5p的表达能够减轻顺铂诱导的小鼠肾损伤，但其具体机制尚未阐明。这些研究都提示miR-192-5p 或在AKI 过程中起着重要作用。本研究发现，顺铂处理的人近端肾小管上皮细胞miR-192-5p表达降低，而其靶基因Notch3 表达升高。进一步发现过表达miR-192-5p后，其靶基因Notch3 的表达被显著下调，同时cleaved-caspase3 表达及细胞凋亡率降低，这提示miR-192-5p可通过抑制其靶基因Notch3的表达，进而抑制线粒体凋亡途径，导致细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase3 表达降低，减轻肾小管上皮细胞凋亡，但这其中的具体机制仍需进一步在动物实验中论证。

Notch3 是AKI 损伤的一种重要介质，本研究证实miR-192-5p 可通过下调Notch3 表达来减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡，这或能为急性肾损伤的防治提供一种新的研究思路和治疗策略。