精神分裂症断裂基因1启动子的高甲基化增加阿尔茨海默病的发病风险*

鲍荣荣 陈韦华 王 欣 许春双 牛艳芳 王 芳 楼 琼宋 飞 朱斌斌 王钦文* 徐淑君1，***

（1）宁波大学医学院，浙江省病理生理学重点实验室，宁波315211；2）宁波大学医学院附属医院神经内科，宁波315020；3）宁波医疗中心李惠利医院神经内科，宁波315000；4）浙江医药高等专科学校，宁波315000；5）宁波大学医学院附属医院麻醉科，宁波315020）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性的神经退行性疾病，临床上主要表现为渐进性的认知功能减退、学习记忆能力下降和精神行为异常，在老年人群中AD发病率占各类痴呆的60%以上［1］，并且随着平均寿命的增加，AD的发病率也会急速上升［2］。

AD 是一个受环境和基因影响的复杂疾病，其中70%AD 发生的风险因素是由于遗传改变引起的［3］。AD主要的致病蛋白β淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）是由40 或42 个氨基酸构成的短肽，是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的水解产物［4］。APP是一种跨膜蛋白，在细胞生理功能的调节中起重要作用，它参与突触发生和突触可塑性［5］。APP在体内的裂解存在两种途径：一种是α 分泌酶在Aβ 结构域内切割，产生具有神经营养功能和神经保护作用的APP 片段，称为非淀粉样肽源途径（non-amyloidogenic）［6］；另一种是β位 点 剪 切 酶（β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1）和γ 剪切酶在Aβ 结构域的两端切割，产生Aβ片段，称为淀粉样肽源途径（amyloidogenic）［7］。大量研究都表明，BACE1基因删除或表达抑制后，Aβ 生成显著减少［8］。因此，BACE1的调节在AD发生发展中起着重要的作用。

精神分裂症断裂基因1 （disrupted-inschizophrenia-1，DISC1）位于1号染色体，最初发现于一个精神疾病高发的苏格兰家族［9］。DISC1的基因突变与精神分裂症、双向情感障碍、重度抑郁症等精神疾病的发病有着密切联系［10］。最近的全基因组关联性分析发现，DISC1的一个单核苷酸多态性（SNP1q42，rs6675281）与AD的发病有显著相关性［11］。在皮质发育过程中，DISC1和APP的结合在神经元迁移中起关键作用，增加DISC1的表达挽救了由APP 表达缺失引起的迁移缺陷［12］。在8 月龄APP/PS1AD 转基因鼠中，DISC1的表达下降，增加DISC1的表达会促进BACE 1往溶酶体的转运，从而导致BACE 1在溶酶体的降解［13］。据此，可以推断DISC1和AD 的发病有着显著相关性。

表观遗传学是连接环境与遗传基因变化的桥梁，DNA 甲基化是一种经典表观修饰，参与多种疾病的发生，包括糖尿病、精神分裂症、AD等［14］。然而目前有关人体血液样本中DISC1的甲基化修饰与AD的相关性尚不清楚。本研究采用亚硫酸氢盐转化后焦磷酸测序分析的方法，检测了中国汉族51 例AD 患者和63 例健康对照者DISC1的甲基化水平，分析其与AD发生的关系。

1 材料与方法

1.1 血液样本收集

本研究收集了来自宁波第一医院和宁波康宁医院的散发性AD患者51例（男性27人，女性24人）和与AD组性别、年龄相匹配的正常对照63例（男性39人，女性24人）。散发性AD患者由两位有经验的神经内科临床医生（CZ 和ZQ）根据ICD-10、国家神经和交流障碍及中风-阿尔茨海默病的相关疾病协会标准诊断，结合患者的病史和家族史、神经系统检查、血液研究、脑成像研究、神经心理测试和认知筛查测试等方法进行判定。所有的对照人群都没有任何类型的身体或精神障碍。所有参与者为居住在宁波市的汉族人。本研究经宁波大学伦理委员会审核批准。所有参与者或其监护人均已签署知情同意书。

1.2 生化因子检测

分别采用双缩脲法和溴甲酚绿法测定血清总蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，ALB）浓度，球蛋白（globulin，GLB）计算为TP 减去ALB。采用速率法测定谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的含量。使用循环酶法测定总胆汁酸（total bile acid，TBA）和同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy） 的水平。采用酶法测糖（glucose，Glu）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、肌酐（creatinine，CRE）和尿酸（uric acid，UA）含量。使用一步检测法测定高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。通过比浊法测量载脂蛋白A（apolipoprotein A，ApoA）和载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）含量。分别采用终点法和胶乳凝集法检测血清脂蛋白a（lipoprotein A，Lp（a））和C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）浓度。使用免疫比浊法检测载脂蛋白E（apolipoproten E，ApoE）水平。

1.3 亚硫酸氢盐转化后焦磷酸测序分析

用核酸提取分析仪（Lab-Aid 820，厦门，中国） 根据操作规程从外周血提取DNA。使用Nanodrop 1000测定DNA浓度和纯度。通过亚硫酸氢 钠DNA 转 化 化 学（EpiTech Bisulfite Kits；Qiagen） 和 聚 合 酶 链 式 反 应（PCR） 扩 增（Pyromark PCR试剂盒；Qiagen）制备DNA。为检测DISC1甲基化水平，使用Pyromark Q24 仪器进行焦磷酸测序分析。用于甲基化定量的PCR 正向引 物：5＇-GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3＇、反向引物：5＇-生物素-CCTAAACTACCTCCTACTCCT-3＇和 测 序 引 物：5＇-GTTAATGTTGGAAAGGAAAT-3＇。

1.4 统计分析

采用SPSS 软件16.0进行统计学分析，采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U秩和检验来确定AD病例和对照之间基线数据的差异。通过Pearson或Spearman 相关性检验评估DISC1甲基化与代谢特征之间的关联（P＜0.05 被认为具有统计学意义）。

2 结 果

2.1 DISC1启动子的CpG岛区甲基化分析

对DISC1启 动 子 的CpG 岛 区 （chr1：231 762 415～231 763 115） 进 行 焦 磷 酸 测 序（图1），共测量2 个CpG 位点，发现2 个CpG 位点的甲基化水平之间存在显著相关性（r＞0.671，P＜0.001，表1），因此在随后的分析中进一步测量了2种CpG的平均DNA甲基化。

Fig.1 Correlations among seven promoter CpG sites of DISC1

Table 1 Comparisons of DISC1 methylation levels between cases and controls

2.2 生化因子与AD之间的关联分析

本研究共纳入51 名AD 患者和63 名对照。在19 个临床特征中（表2），AD 组中ALB、Lp（a）和Hcy 水平均高于对照组（P=0.04，P=0.000 4，P=0.01）；AD 组ALT、HDL-C 和CRP 水平低于对照组（P=0.04，P=0.000 4，P=0.02）。通过Logistic回归分析进一步证实Lp（a）升高增加AD 的风 险（OR（95% CI）=19.72 （2.072, 187.693），P=0.009，表3）。

2.3 DISC1甲基化与AD 的相关性分析

本研究结果表明，DISC1的两个CpG 位点在AD 组均能观察到显著的甲基化水平升高（P=0.000 7；P=2.27E-6，表1）。通过ROC 曲线用来评估诊断能力［15］，DISC1启动子甲基化的曲线下面积（ACU） 为0.726 （95% CI：0.626～0.827），灵敏度和特异度分别为0.569和0.869（图2）。这些结果表明，DISC1启动子高甲基化可能是AD 潜在的生物标志物。运用Logistic 回归分析评估AD 的风险，结果显示，DISC1启动子高甲基化增加了AD 的风险（OR（95% CI）=2.403（1.117，5.171），P=0.025，表3）。随后进一步分析DISC1启动子甲基化与患者生化指标之间的相关性（图3），女性患者中ApoA（r=0.490，P=0.003）与DISC1启动子甲基化呈正相关（r=0.431，P=0.010）；男性患者中Lp（a）与DISC1启动子甲基化呈正相关（r=0.538，P=1.14E-4）。

Table 2 Characteristics of subjects from cases and controls

Table 3 Logistic regression analysis of the risk of AD

Fig.2 The receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of AD

Fig.3 Correlations between biochemical parameters of samples and DISC1 promoter methylation level

3 讨 论

本研究分析了AD患者和对照组DISC1的启动子甲基化水平，以阐明DISC1的启动子甲基化与AD 的关联性，结果显示AD 组的甲基化水平显著高于对照组。AD的ROC曲线也表明DISC1的启动子高甲基化可以作为AD的潜在生物标志物。相关分析显示，ApoA 与DISC1的启动子甲基化在女性病例中呈正相关；Lp（a）与DISC1的启动子甲基化在男性病例中呈正相关。

外周血样本方便易得，且甲基化水平与脑组织甲基化水平具有良好的一致［16-17］。本研究表明，AD 组的DISC1启动子甲基化程度显著高于对照组，DISC1启动子的高甲基化可能会降低DISC1的表达，进而导致AD 发生。以往的研究表明，在8月龄APP/PS1AD 转基因鼠中，DISC1的表达下降［13］，本研究结果提示在AD 病人中也存在类似的改变。DISC1 降低参与AD 的可能机制是，DISC1 下降使BACE1 往溶酶体的转运降低，从而导致BACE 1在溶酶体的降解减少［13］。DISC1含有LC3 的结合位点，DISC1 有助于促进Aβ 引起的受损线粒体自噬，而DISC1 降低，使线粒体自噬过程受阻，从而引起突触可塑性损伤和AD认知功能障碍［18］。

本研究检测了19个生化与AD的关联性，发现AD 组中ALB、Lp（a）和Hcy 水平均高于对照组。AD组ALT、HDL-C和CRP水平低于对照组。血浆Hcy 水平的增加被认为是AD 的危险因素，并且最近的研究已经证明Hcy浓度的增加能增加总Tau和磷酸化Tau，并形成Tau 寡聚体，从而增加AD 风险［19］。之前的研究也证实了中度AD 患者血浆CRP 水平的降低［20］。此外，较低的CRP 水平与较快的认知衰退相关［21］。

为了找出DISC1启动子甲基化与生化指标之间的关联，本研究还进行了相关分析。结果显示，ApoA 水平与女性DISC1启动子甲基化有关，Lp（a）水平与男性DISC1启动子甲基化有关。ApoA有转运胆固醇和调节炎症的作用，并且影响Aβ 聚集和沉积［22］，因此ApoA 也被视为神经退行性疾病潜在的诊断标志物［23］；临床研究结果证实，Lp（a）血清浓度与AD风险呈非线性关系显著相关，可能的原因是Lp（a）血清浓度的升高会增加脑血管疾病的风险从而间接影响AD的发病［24］。

4 结 论

总之，本研究表明，AD 患者DISC1启动子的甲基化水平显著高于对照组，外周血DISC1启动子高甲基化是AD 发生的高风险因素，其可能是AD诊断潜在的生物标志物。