过磷酸钙、生物炭、腐殖酸对双孢菇胞外酶活性和营养成分的影响

方志荣 林 静 清 源 王雪梅

（1西昌学院资源与环境学院，四川西昌 615013；2西昌学院攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室，四川西昌 615013）

作物秸秆是农作物生产循环中重要的生物质资 源，包括玉米秸秆、稻草、小麦秸秆、油菜秸秆等。我国是农业大国，也是秸秆资源较为丰富的国家之一。国家统计局的资料显示，2020年我国玉米产量达2.606 7亿t，按照玉米籽粒∶玉米秸秆=1.0∶1.2的比例计算，约产生玉米秸秆3.1亿t。储量巨大的玉米秸秆资源若不能得到充分利用，将对循环农业的发展直接起到阻碍作用。

我国早期对玉米秸秆的处理方式主要是焚烧，这样会带来严重的空气污染和生态问题。近年来，随着有关政策的实施，农民已经转变了传统的秸秆处理方式。目前，秸秆资源的主要利用方式为秸秆还田、能源化、饲料化、基料化、原料化等，以四川省为例，秸秆还田占资源总量的44%，基料化的比例为5.2%[1]。虽然秸秆还田短期内在一定程度上可以改良土壤的物理性质与土壤内部的生态环境，增加土壤微生物的多样性，提高耕地的生产力，但由于玉米秸秆结构复杂，碳氮比高，不易降解，从长远角度看，将影响土壤墒情和耕作。此外，未腐烂的玉米秸秆将大量的致病菌和虫卵带入土中，造成致病菌和虫卵大量繁衍，给下茬作物的生长带来不利影响。

双孢菇（Agaricus bisporus（Lange） Sing.）又称蘑菇、双孢蘑菇等，属真菌门担子菌纲伞菌目蘑菇科蘑菇属大型真菌，是世界上栽培地域最广、生产规模最大、产量最高的一种食用菌，其产量约占食用菌产量的40%，也是我国目前出口量较大、创汇较多的食用菌产品之一[2]。

刘顺德等[3]研究表明，玉米秸秆中含有粗灰分6.26%～6.74%、粗纤维37.94%～39.10%、木质素32.01%～32.38%，有机物含量高达90.73%～90.95%。相关研究表明，双孢菇能够通过胞外酶的作用降解玉米秸秆中的木质素和纤维素，产生的子实体能为人类提供营养成分和多种药用成分。因此，以玉米秸秆作为双孢菇的培养料经济效益巨大[4-6]。

目前，双孢菇栽培主要采用发酵料栽培技术，发酵方法有一次发酵[6-8]、二次发酵[5，9]、隧道发酵[10-11]等。相比一次发酵（秸秆发酵），二次发酵和隧道发酵不仅提高了整个菇棚的消毒程度，双孢菇单产水平也有不同程度的提高[9-11]。在一次发酵过程中，微生物发酵常常会使物料产生大量氨气；在二次发酵或隧道发酵过程中，当发酵温度维持在45.0～46.0℃时，会产生大量放线菌，发酵产生的氨气在有氧条件下被放线菌固定，降低了培养料中氮的损失[9-11]。然而，二次发酵特别是隧道发酵技术要求高，一次发酵具有成本低、便于在广大农村地区推广等优点。因此，开展一次发酵对于广大农村玉米秸秆基质化及乡村振兴具有重要意义。一次发酵过程中，如果发酵料中存有氨气，对双孢菇菌种危害极大，易使双孢菇菌种不能萌发成活。传统除氨的做法是高温时（60℃）在1 m左右的空中用铁锹等抖动发酵混合物散氨，然后摊开降温。这样不仅导致大量氨气散发到空气中，引起环境污染，而且会造成发酵料氮的损失，降低发酵料的质量。

过磷酸钙是食用菌生产中常用的辅料。过磷酸钙不仅可以补充培养料中磷、钙含量，而且可以促进微生物的分解活动，有利于培养料的发酵腐熟[12]。此外，过磷酸钙含有的游离酸可与氨反应，是潜在的堆肥挥发氨气回收固定的吸附剂[13]。吴娟[14]研究表明，添加物料干重10%以上的过磷酸钙可以显著降低堆肥过程中NH3等的排放，增加堆肥产品中30%总碳含量以及40%总氮含量。李 帆等[15]研究表明，添加物料干重5%～15%的过磷酸钙可以有效抑制堆肥过程中铵态氮的挥发损失，增加堆肥的全氮和全磷含量。刘 微等[16]研究表明，秸秆炭具有孔隙度高、比表面积大的优点，有利于堆肥中微生物附着生存，堆肥后秸秆炭表面原-OH官能团含量增加，可以固定堆肥过程中产生的氨，减少堆肥过程中氮的损失。荣荣等[17]研究表明，5%～15%的生物炭能降低堆肥过程中NH3的挥发，并促进保氮过程，氨气的排放量比对照减少63.75%～92.63%。孔凡克等[18]研究表明，发酵物中加入腐殖酸能提高堆肥中全氮、硝态氮和铵态氮含量，降低氮的损失。现有发酵料栽培双孢菇技术过磷酸钙的使用量一般为0～2%[7-9]。已有研究证实，稻草发酵料中加入10%的过磷酸钙（干质量分数）能显著提高双孢菇的产量和品质，但发酵混合物中添加5%以上的过磷酸钙、过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙+腐殖酸对双孢菇胞外酶活性、产量和营养成分的影响尚无报道。

本研究在玉米秸秆发酵料中添加过磷酸钙、过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙+腐殖酸，研究其对双孢菇不同生长阶段胞外酶活性、出菇期、生物学效率、营养成分等的影响，旨在为一次发酵法栽培双孢菇提供参考。现将试验结果总结如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌种为双孢菇W192，购于华沃生物科技有限公司；其他供试材料有金宝贝10型食用菌栽培料发酵助剂（购于北京华夏康源科技有限公司）、生物炭（购于立泽环保科技有限公司）、腐殖酸（购于北京澳佳生态农业股份有限公司）、玉米秸秆（购于西昌市农户）。

1.2 试验方法

1.2.1 培养料发酵处理。将晒干的玉米秸秆用铡草机切成2～5 cm长的节段，按照预湿、拌料、建堆、翻堆的方法进行培养料发酵，具体过程如下。将玉米节段摊在水泥地上，喷洒1%石灰水，使其慢慢吸入大部分的水分。然后向玉米秸秆中添加过磷酸钙、生物炭、腐殖酸等：添加秸秆干物质量10%的过磷酸钙（处理P）；添加秸秆干物质量10%的过磷酸钙+10%的生物炭（处理P+BC）；添加秸秆干物质量10%的过磷酸钙+0.25%的腐殖酸（处理P+HA），同时加入稀释的金宝贝10型食用菌栽培料发酵助剂（发酵助剂按照玉米秸秆干物质量的0.2%加入，并按照1∶25的比例采用玉米面进行稀释）；添加秸秆干物质量1%的尿素，以不添加过磷酸钙作为对照（CK）。调节混合物料含水率约为60%，用石灰将pH值调至8～9。将主料与辅料搅拌混匀后，按常规堆置，堆内用直径10 cm左右的尖头木棒均匀打孔通气，用厚膜覆盖。当料温上升至65℃左右时，进行第1次翻堆；3～4 d后再次翻倒，翻堆3次，待发酵腐熟料达到黄褐至棕褐色、松软有弹性、手拉即断、无臭味、无氨味，即完成培养料的发酵处理，整个发酵过程20 d。

1.2.2 双孢菇畦栽及管理。在大棚内铺一层1 m宽的地膜，地膜两侧铺规格为240 mm×115 mm×53 mm的空心砖作为步道，将发酵好的培养料按照2 kg/m2的用种量采用层播法进行播种。具体做法：先在地膜上方铺第1层料（厚度10～12 cm），将购买的菌种掰成核桃大小，菌种与菌种之间相距10 cm，呈梅花形摆放，第1层菌种用种量为总量的1/3。按照上述方法铺第2层料（10～12 cm）、播种第2层菌种（用种量为总量的2/3），再铺第3层料（厚度3～5 cm），上层覆盖地膜发菌。

播种后30 d，双孢菇菌丝布满料层，去掉地膜并覆土。覆土材料为地表耕作层0～20 cm的土壤，去掉上层的枯枝落叶后风干破碎，过1 cm孔筛，拌入1%石灰粉，混匀起堆闷2 d后备用。在料面上铺3 cm左右厚的土，覆盖后浇水，使覆土手抓成团、放手即散（即土壤湿度达65%左右），再用地膜覆盖畦床，待双孢菇菌丝体伸出土层时，揭去地膜，进行出菇管理。

1.3 生物学相关指标及酶活性测定

1.3.1 菌丝体生长阶段相关指标测定。

（1）采样。采用交叉五点取样法，用柱状土壤采集器采集3层培养料（原基生长阶段和子实体生长阶段先去掉表层覆盖土），各点样品采集后混合均匀，采用四分法取200 g样品用于胞外酶分析，测定营养生长期菌丝体羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性。

（2）粗酶液的提取。20g发菌料加蒸馏水100mL，25℃下浸提4 h，过滤后，4 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。另取20 g发菌料于80℃的鼓风干燥箱中烘干至恒重，采用上述方法提取上清液作为对照[19]。

（3）羧甲基纤维素酶活性的测定。采用DNS比色法测定[19]，羧甲基纤维素酶的活力单位为在50℃条件下反应1 min产生相当于1 μg分子葡萄糖的还原糖的酶量。

（4）半纤维素酶的测定。采用DNS比色法测定[19]，半纤维素酶的活力单位为在50℃条件下反应1 min产生相当于1 μg分子葡萄糖的还原糖的酶量。

（5）漆酶的测定。采用邻甲苯胺氧化法测定[19]，将1 g干物质中的酶含量单位时间内使OD600值改变0.01定义为一个漆酶活力单位。

（6）淀粉酶的测定。采用DNS比色法测定[19]，将1 g干物质与底物反应1 min释放1 μg葡萄糖定义为一个淀粉酶活力单位。

（7）过氧化物酶的测定。采用愈创木酚法测定[19]，将1 g干物质中的酶含量单位时间内使OD470值改变0.01定义为一个过氧化物酶活力单位。

1.3.2 子实体生长阶段相关指标测定。待双孢菇子实体七八成熟时采收，记录每个处理下双孢菇的现蕾时间、首次采菇时间、第一潮菇鲜菇产量，计算不同配方的生物学效率，采集第一潮菇进行干物质、总糖和粗蛋白含量的分析。计算公式如下：

生物学效率（%）=鲜菇重/干料重×100

按照上述方法采集发菌料，测定子实体阶段菌丝体羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶等胞外酶的活性。

1.3.3 子实体营养成分测定。每处理采集10个子实体，记录子实体的鲜重，将其放入鼓风干燥箱中105℃烘10 min，后在80℃的条件下烘干至恒重，测其干物质含量。将烘干后的子实体粉碎，过10目筛，材料用于测定粗蛋白含量和总糖含量。粗蛋白含量采用纳氏比色法测定[20]。测定总糖时，先采用盐酸水解[21]，再采用蒽酮比色法测定[22]。

1.4 数据统计与分析

利用SPSS 23.0对胞外酶活性和子实体营养成分进行方差分析，并用LSD进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同处理对双孢菇菌丝体生长阶段和子实体生长阶段胞外酶活性的影响

在双孢菇生长发育过程中，菌丝体会产生羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、过氧化物酶、淀粉酶等，分泌到菌丝体外，将培养料中的纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、果胶等大分子物质水解成小分子物质，以供菌丝体、子实体吸收和利用。如图1所示，与CK相比，处理P、P+BC、P+HA的发酵料显著提高了双孢菇菌丝体、原基、子实体生长阶段羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、淀粉酶、过氧化物酶的活性。

图1 过磷酸钙、生物炭、腐殖酸对双孢菇不同生长阶段胞外酶活性的影响

羧甲基纤维素酶是一类将纤维素分解为葡萄糖的酶，各处理在菌丝体、原基、子实体生长阶段羧甲基纤维素酶的活性大小顺序为处理P+HA≈处理P＞处理P+BC＞CK。在原基生长阶段，羧甲基纤维素酶的活性提高，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA羧甲基纤维素酶的活性分别较菌丝体生长期提高了2.40倍、1.52倍、1.57倍和1.54倍。子实体生长阶段，羧甲基纤维素酶的活性略有降低，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA羧甲基纤维素酶的活性分别较原基生长阶段下降了44.90%、4.23%、11.20%、3.49%。

半纤维素酶可将半纤维素分解为五碳糖、六碳糖和糖醛酸，各处理半纤维素酶的活性大小顺序在菌丝体生长阶段为处理P+HA≈处理P≈处理P+BC＞CK。在原基生长阶段，半纤维素酶的活性下降，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA半纤维素酶的活性分别较菌丝体生长期下降了19.3%、65.6%、56.2%、58.5%，各处理半纤维素酶的活性大小顺序为处理P+BC＞处理 P+HA＞处理 P＞CK。 CK、处理 P、处理 P+BC半纤维素的活性在子实体生长阶段继续下降，分别较原基生长阶段下降了26.0%、29.3%、78.6%；处理P+HA半纤维素酶的活性在子实体生长阶段上升，较原基生长阶段提高了79.2%；各处理半纤维素酶的活性大小顺序为处理P+HA＞处理P＞处理P+BC＞CK，子实体生长阶段处理P+HA半纤维素酶的活性显著高于其他3个处理。

漆酶是木质素分解相关的酶，可将木质素分解为复杂的小分子化合物，各处理漆酶的活性在菌丝体时期最高，其大小顺序为处理P＞处理P+HA＞处理P+BC＞CK。在原基生长阶段，漆酶的活性下降，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA漆酶的活性分别较菌丝体生长期下降了 42.60%、32.50%、28.94%、20.12%，各处理漆酶的活性大小顺序为处理P≈处理P+HA＞处理P+BC＞CK。在子实体生长阶段，漆酶的活性继续下降，CK、处理 P、处理 P+BC、处理 P+HA漆酶的活性分别较原基生长阶段下降了72.7%、76.5%、78.3%、79.9%，各处理漆酶的活性大小顺序为处理P＞处理P+HA＞处理P+BC＞CK。

淀粉酶可将小分子的碳水化合物分解为葡萄糖，各处理淀粉酶活性在原基生长阶段最高，而在子实体生长阶段下降。菌丝体生长阶段，各处理淀粉酶活性大小的顺序为处理P+BC＞处理P＞处理P+HA＞CK。在原基生长阶段，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA淀粉酶的活性分别较菌丝体生长阶段提高了2.04倍、1.96倍、1.01倍、1.19倍，各处理淀粉酶活性大小顺序为处理P＞处理P+BC＞处理P+HA＞CK。在子实体生长阶段，CK、处理 P、处理 P+BC、处理 P+HA淀粉酶的活性分别较原基生长阶段下降了80.6%、80.5%、92.5%、69.5%，各处理淀粉酶活性大小顺序为处理P＞处理P+HA＞处理P+BC＞CK。

过氧化物酶是另一种木质素分解相关的酶，可将木质素分解为复杂的小分子化合物，各处理过氧化物酶活性大小顺序在菌丝体生长阶段为处理P+HA＞处理P+BC＞处理P＞CK。在原基生长阶段，过氧化物酶的活性上升，CK、处理P、处理P+BC、处理P+HA过氧化物酶的活性分别较菌丝体生长阶段提高了83.8%、17.0%、31.3%、17.0%，各处理过氧化物酶活性大小的顺序为处理P+HA＞处理P+BC＞处理P＞CK。在子实体生长阶段，过氧化物酶的活性上升，CK、处理P、处理P+HA过氧化物酶的活性分别较原基生长阶段提高了9.5%、20.0%、30.8%，处理P+BC过氧化物酶的活性较原基生长阶段下降了5.1%，各处理过氧化物酶活性大小的顺序为处理P+HA＞处理P+BC≈处理P＞CK。子实体生长阶段处理P+HA过氧化物酶的活性显著高于其他3个处理。

2.2 不同处理对双孢菇生物学效率的影响

由表1可知，处理P双孢菇现蕾时间和首次采菇时间较CK、处理P+BC、处理P+HA短，处理P+HA、处理P+BC的现蕾时间和首次采菇时间较晚。处理P+HA第一潮菇鲜菇产量最高，达21.7 kg/m2，生物学效率达24.1%，第一潮菇鲜菇产量表现为处理P+HA＞处理P＞处理P+BC＞CK，生物学效率表现为处理P+HA＞处理P＞处理P+BC＞CK。结果表明：添加过磷酸钙+腐殖酸、过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙能提高双孢菇的产量，其中以添加过磷酸钙+腐殖酸的效果最好，但其会延迟双孢菇的现蕾时间和首次采菇时间。

表1 不同处理对双孢菇生物学效率的影响

2.3 不同处理对双孢菇营养成分的影响

由表2可知，与CK相比，处理P、处理P+BC、处理P+HA的发酵料显著提高了双孢菇干物质、总糖和粗蛋白的含量，干物质大小的顺序为处理P+HA＞处理P+BC≈处理P＞CK，总糖含量的大小顺序为处理P≈处理P+HA＞处理P+BC＞CK。双孢菇中含有丰富的蛋白质，各处理的双孢菇蛋白质含量的顺序为处理 P＞处理 P+HA＞处理 P+BC＞CK， 处理 P、P+BC、P+HA的双孢菇蛋白质含量分别较CK提高了94.0%、21.3%、80.4%。

表2 不同处理对双孢菇品质的影响 单位：%

3 结论与讨论

食用菌胞外酶的活性大小与食用菌的种类、不同生理发育期和培养基的组成等有关[18]。双孢菇属于异养型真菌，其自身能通过分解培养料中的纤维素、半纤维素、木质素等获得生长所需的碳源[5]。因此，双孢菇胞外酶活性的高低直接影响其对上述物质的降解能力，也影响了双孢菇的现蕾时间、首次采菇时间、鲜菇产量、粗蛋白含量、总糖含量。本试验结果表明，发酵料中添加过磷酸钙、过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙+腐殖酸会增加双孢菇在菌丝体、原基、子实体生长阶段羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、过氧化物酶、淀粉酶的活性，能增加第一潮菇鲜菇产量、生物学效率、干物质含量、粗蛋白含量、总糖含量。综合来看，玉米秸秆发酵料中添加过磷酸钙+腐殖酸的情况下，双孢菇生物学效率和粗蛋白含量最高。

双孢菇对基料的降解是菌丝体和子实体生长发育的基础，生长发育期内基料中的木质素、纤维素和半纤维素被菌丝体分泌的胞外酶如漆酶、过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶强烈降解[5]，因而胞外酶活性的高低直接影响双孢菇的生物学效率和营养成分。与不添加过磷酸钙对照相比，添加过磷酸钙、过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙+腐殖酸处理双孢菇在菌丝体、原基、子实体生长阶段羧甲基纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、漆酶、过氧化物酶的活性显著增加，提高了双孢菇对纤维素、半纤维素、木质素的分解能力，为双孢菇生长提供了充足的碳源。子实体生长阶段需要大量碳源，添加过磷酸钙、过磷酸钙+腐殖酸处理纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、过氧化物酶的活性高于不添加过磷酸钙对照、过磷酸钙+生物炭处理，从而为双孢菇的原基分化、子实体生长提供了充足的碳源，这可能是添加过磷酸钙、过磷酸钙+腐殖酸处理双孢菇第一潮菇鲜菇产量、生物学效率高于不添加过磷酸钙对照、过磷酸钙+生物炭处理的原因之一。李晓博[5]研究表明：双孢菇生长发育的整个阶段纤维素酶和半纤维素酶的活性都很高，其中在出菇阶段最高，酶活性变化与纤维素、半纤维素的降解速率成正比；漆酶和过氧化物酶活性在覆土阶段达到最大值，此后开始下降，在出菇阶段维持在较低水平。本研究中，羧甲基纤维素酶和漆酶的变化趋势与李晓博的研究结果一致，但是半纤维素酶和过氧化物酶却表现出不一致的变化趋势，可能与培养料只进行了1次发酵有关。

杨亚茹等[23]研究表明，在堆肥期和出菇期，宜优先利用半纤维素和纤维素，木质素利用率较低。本研究中，漆酶在菌丝体生长阶段活性最高，在原基生长阶段活性降低，在子实体生长阶段维持在较低水平。但是另外一种木质素降解酶过氧化物酶的活性随菌龄的增加而增强，并在出菇期维持较高的水平。过磷酸钙+腐殖酸处理过氧化物酶的活性显著高于其他3个处理，增加了双孢菇对培养料中木质素的利用率。此外，在子实体生长阶段，不添加过磷酸钙对照、添加过磷酸钙、过磷酸钙+生物炭处理半纤维素酶的活性下降，过磷酸钙+腐殖酸处理半纤维素酶的活性提高，过磷酸钙+腐殖酸处理半纤维素酶的活性在子实体生长阶段显著高于其他3个处理，增加了双孢菇对培养料中半纤维素的利用。过磷酸钙+腐殖酸处理提高了过氧化物酶和半纤维素酶的活性，从而增加了双孢菇对培养料中木质素和半纤维素的利用，为双孢菇子实体的生长提供了丰富的碳源，可能是其第一潮菇鲜菇产量、生物学效率高于其他3个处理的原因。

除碳源外，双孢菇的生长还需要充足的氮源，氨基酸、维生素等营养物质的合成均需要氮素的参与。培养料中不同的碳氮比将影响双孢菇的产量和品质，综合考虑其适宜的碳氮比为25.4∶1.0[24]。堆肥（发酵料）中加入过磷酸钙、生物炭、腐殖酸降低了堆肥（发酵）过程中NH3的排放，增加了堆肥（发酵料）中的总碳和总氮含量[14，17-18]。蛋白质含量是评价双孢菇品质的指标之一，添加过磷酸钙、过磷酸钙+腐殖酸处理的发酵料中可能含有更丰富的氮源，从而为双孢菇的营养生长和生殖生长提供了更充足的营养物质，粗蛋白含量较不添加过磷酸钙对照显著提高。过磷酸钙+腐殖酸处理第一潮菇鲜菇产量、生物学效率、粗蛋白含量较高，可应用于实际生产。

廖剑华[25]研究表明，W192的菌丝在PDA平板上生长的pH值范围为5～9，适宜生长平板pH值为7。本试验堆肥后培养料pH值的差异，可能导致W192菌丝在培养料中生长速度存在差异，这可能是过磷酸钙+生物炭、过磷酸钙+腐殖酸处理现蕾时间、首次采菇时间较添加过磷酸钙处理延迟的原因之一。石膏可以补充培养料中的硫、钙元素，有利于堆肥中游离氨气的稳定，减少氮素的损失，对pH值具有缓冲作用，生产中可以添加培养料干重1%～2%的硫酸钙[12]。因此，可在过磷酸钙+腐殖酸处理的基础上加入一定量的硫酸钙，但其对双孢菇现蕾时间、首次采菇时间、鲜菇产量、生物学效率及营养成分的影响还需要进一步验证。