贝莱斯芽胞杆菌JK19发酵液稳定性及抑菌物质初步分析

黄 伟，张丽娟，秦新政，王 宁，王 玮

（新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐 830091）

贝莱斯芽胞杆菌Bacillusvelezensis在2016年经过学界的反复论证后，才获得了公认的分类学地位[1]。它在自然界中分布广泛，易于实验室分离和培养，对环境友好，其代谢产物丰富，能促进植物生长和拮抗病原菌，因此该菌在农业领域发挥着越来越重要的作用[2,3]。贝莱斯芽胞杆菌的代表菌株FZB42，在美国已实现商业化生产，对农作物细菌和真菌类病害都能起到较好的防治效果[4-6]。在国内贝莱斯芽胞杆菌9912D于 2016年经中华人民共和国农业部批准成为新型生物杀菌剂，它能产生多种生物活性物质，特别是抗菌脂肽，在高效防治黄瓜灰霉病、番茄灰霉病、棉花枯萎病和苹果腐烂病等植物病害领域具有重要意义[7]。目前研究芽胞杆菌与青枯病菌互作的生防机制成为研究热点之一，而研究较多的是脂肽类化合物产生的拮抗作用，曹禺等[8]研究贝莱斯芽胞杆菌Y6和F7对番茄青枯病病原菌菌假单胞菌Ralstoniasolanacearum的防治机理时，构建了脂肽表面活性素（surfactin）、伊枯菌素（iturin）和丰原素（fengycin）合成基因缺失株，结果表明伊枯菌素或丰原素均对青枯病菌有显著的拮抗效果。解淀粉芽胞杆菌JK6和甲基营养型芽胞杆菌Y2可有效防治番茄青枯病菌，其抗菌活性成分是表面活性素[9]。芽胞杆菌在植物病害生物防治中潜力巨大，但是部分芽胞杆菌产生的活性物质易受到温度、光照和pH的影响，造成稳定性下降，不利于田间施用[7]。枯草芽胞杆菌a1产生的抗真菌活性物质在pH＞8.0时，其活性降低[10]。苏云金芽胞杆菌Bt185发酵上清液在50 ℃以上高温处理后抑菌活性开始下降[11]。因此，对稳定性进行研究有助于提高微生物菌剂的防治效果。

本研究前期从耐辐射微生物资源库中筛选得到一株对青枯病菌有较好抑菌效果的贝莱斯芽胞杆菌JK19，但菌株JK19防治青枯病菌的抑菌物质及其稳定性仍需进一步研究，通过对菌株JK19发酵上清液稳定性及其拮抗活性物质进行探究，为新型生物农药的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株：贝莱斯芽胞杆菌JK 19由本课题组分离保存。

试验试剂：硫酸铵，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，盐酸，甲醇，乙酸乙酯均购自北京鼎国生物有限公司；0.22 μm微孔滤膜；蛋白酶K，胰蛋白酶，胃蛋白酶，脂肪酶均购自上海源叶生物有限公司。

试验仪器：FA-2204型电子天平，上海衡平仪器仪表厂；DHP-052型恒温振荡培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Rot ina 380r型高速冷冻离心机，郑州长城科工贸有限公司；SX-500型高压灭菌锅，日本TOMY公司；SW-CJ-2FD型无菌超净工作台，苏州净化设备有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；79-3型磁力搅拌器，郑州宝晶电子科技有限公司；TQ8040NX三重四极杆型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；autoflex speed型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），德国布鲁克（北京）科技有限公司。

NB培养基：牛肉浸膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，利用蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0；NA培养基：牛肉浸膏10 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，琼脂 17 g，利用蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0；BPY培养基：酵母浸粉5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，葡萄糖5 g，利用蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。TTC（Triphey tetrazolium chloride）固体培养基[12]：水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，琼脂17 g，pH 6.5～7.0，利用蒸馏水定容至1 L；使用前冷却至55 ℃，加入过滤除菌的1%的2,3,5-氯化三苯四氮唑，终浓度为0.005%）；CPG液体培养基：水解乳蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，pH 6.5～7.0，定容至1 L。

1.2 菌株JK19发酵上清液无菌滤液的制备

挑取在NA培养基中活化的菌株JK19，接种至盛有50 mL NB液体培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、180 r/min的条件下振荡培养24 h得到种子液，将种子液以1%（v/v）的接种量接种于含有100 mL BPY培养基的500 mL三角瓶中，同样条件下培养96 h得到发酵液。将上述发酵液于4 ℃、4500 r/min离心20 min除去菌体，得到上清液，再用0.22 μm微孔滤膜过滤，得到无菌滤液，4 ℃保存备用。

1.3 菌株JK19抑菌活性稳定性的测定

以番茄青枯病菌为指示菌，分别测定JK19发酵上清液在不同环境下（pH、温度、酶和紫外线）的抑菌活性稳定性。抑菌活性的检测采用平板对峙法，将NA平板上活化好的番茄青枯病病原菌，挑取单菌落接种CPG液体培养基，30 ℃、120 r/min振荡培养24 h，作为指示菌种子液。将指示菌种子液与冷却至60 ℃的TTC固体培养基按1∶10比例混匀后倒板[13]。用打孔器（6 mm）在含指示菌的平板打3个孔，将待测液体加入孔内，每孔50 μL，30 ℃静置培养72 h，测量抑菌圈直径（扣除打孔器直径），每个处理设3次重复。

1.3.1 不同pH处理下菌株JK19发酵上清液的抑菌效果稳定性 将发酵上清液分别用 1 mol/L盐酸和1 mol/L氢氧化钠调成不同pH值（2、3、4、5、6、7、8、9、10和11），每个样品体积为50 mL，每个处理重复3次。4 ℃放置过夜后再调回中性（pH＝7.0），作为待测液备用。以加入无菌水，不经酸、碱处理的原样品为对照。

1.3.2 不同温度处理下菌株JK19发酵上清液的抑菌效果稳定性 取上清液分别于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴条件及高温高压（121 ℃、100 KPa）条件处理30 min，置于冰块上快速冷却，每个样品体积为5 mL，每个处理重复3次。处理结束后添加无菌水调制原始体积，作为待测液备用。以4 ℃保存的上清液为对照。

1.3.3 不同酶处理下菌株JK19发酵上清液的抑菌效果稳定性 分别取上清液加入到4个试管（规格15 mL）中，使胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶质量浓度为500 μg/mL。37 ℃孵育2 h，作为待测液备用。以相同浓度的未经蛋白酶处理的上清液作对照[14]。

1.3.4 不同紫外线照射时长下菌株JK19发酵上清液的抑菌效果稳定性 将15 mL上清液倒入到无盖的培养皿中，用磁力搅拌器缓慢搅拌培养皿中的上清液，并置于30 W紫外灯下，距离30 cm分别照射1、2、3、4 h后，作为待测液备用。以未经紫外处理的上清液为对照组。

1.4 提取菌株JK19发酵上清液中的脂肽

按照1.3中的方法获得JK19的无菌滤液，使用6.0 mmol/L的盐酸调节pH至2.0，4 ℃静置过夜，4 ℃、10000 r/min离心30 min后收集沉淀，用等体积100%甲醇萃取2～3次，合并萃取液，然后在旋转蒸发仪中减压蒸干得到脂肽类提取物，使用无水甲醇溶解后，配制成浓度为1 mg/mL的甲醇粗提物溶液，并置于4 ℃冰箱保存备用。

1.5 菌株JK19发酵上清液中脂肽的鉴定

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定甲醇粗提物的成分[15]。确定仪器真空度为10-7mbar或无，开始样品分析时先进行分子量校正，使用337 nm氮激光源解吸和电离，采用α-氰-4-羟肉桂酸为基质，取1 μL样品与等体积的基质混匀，置于仪器离子源进行测定，质量扫描范围为500～2000 Da。

1.6 提取菌株JK19发酵上清液中的易挥发性物质

样品前处理：取1 mL发酵液样品，加入10 mL乙酸乙酯振荡混匀，10000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后用于质谱分析。

GC-MS/MS分析：GC条件为SHIMADZU SH-Rxi-5Sil MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流进样，分流比10∶1；进样口温度为250 ℃，初始温度为30 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。MS条件：EI电离源；载气为He；吹扫流量3 mL/min；电子能量70 eV；离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃。全扫描模式，质量扫描范围为50～600 amu；溶剂延迟2 min。分析所用的数据库为NIST数据库。

1.7 数据统计与分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株JK19抑菌活性的稳定性

随着pH的升高，JK19对青枯病菌的抑菌效果呈先升高后降低的趋势（图1A），在pH 7时，抑菌圈直径达到最大，为（1.59±0.03）cm；pH为2和11时，抗菌活性显著降低，但仍然有较好的抑菌效果，分别为（0.86±0.06）和（1.13±0.06）cm，与pH为7时相比，抑菌圈直径分别下降了45.9%和28.9%，当pH为4.0和10.0时，与pH为7时相比，抑菌圈直径分别下降了18.8%和22.6%，适宜pH为4.0～10.0，说明菌株JK19发酵上清液中的抑菌物质pH范围很广，具有较好的酸碱稳定性。随着温度的升高，菌株JK19对青枯病菌的抑菌效果呈现逐渐下降的趋势（图1B），对温度略敏感，与30 ℃处理相比，超过80 ℃时，抑菌圈直径下降了28%，但121 ℃下依然有抑菌效果，抑菌圈直径为（0.79±0.01）cm，与30 ℃处理相比，抑菌圈直径下降了 48.7%，说明JK19发酵上清液中的抑菌物质具有较好的热稳定性。发酵液经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和脂肪酶处理后，抑菌活性较对照无显著差异（P＞0.05）（图1C），表明菌株JK19发酵液对4种供试的酶不敏感。经紫外照射后，菌株JK19发酵液的抑菌活性没有明显变化，无显著差异（P＞0.05）（图 1D），表明菌株 JK19发酵液在紫外照射下仍具有较强的抑菌作用，具有较好的紫外稳定性。

图1 不同pH（A）、温度（B）、蛋白酶（C）和紫外照射时长（D）对菌株JK19发酵上清液的影响Fig.1 The effect of fermentation supernatant of strain JK19 by different pH (A), temperature (B), protease (C)and UV irradiation duration (D)

2.2 菌株JK19发酵上清液中脂肽粗提液抑菌效果

将获得的粗提液进行平板对峙试验，测得抑菌圈直径为（1.34±0.16）cm（图2）。

图2 菌株JK19发酵上清液脂肽粗提液平板对峙试验Fig.2 Plate confrontation test of lipopeptide crude extract from fermentation supernatant of strain JK19

2.3 菌株JK19发酵上清液中脂肽粗提液的鉴定

将菌株JK19甲醇提取的脂肽粗提液进行MALDITOF-MS 测定，初步分析结果（图3）发现，质谱峰峰值 m/z为 1045.836、1059.885、1067.841、1081.894、1089.862、1103.906和 1119.905，呈现出脂肽的分子量规律，其中1045.836和1059.885，1067.841和1081.894分子量相差14 Da，即一个亚甲基（-CH2-），根据文献报道[16,17]，推测1045.836、1059.885、1067.841和 1081.894为杆菌霉素（Bacillomycin）D的同系物，1045.836和1067.841分别为 C15杆菌霉素 D 的[M+H+]和[M+Na+]，分子量应为 1044；1059.885和 1081.894分别为 C16 Bacillomycin D的[M+H+]和[M+Na+]，分子量应为1058；1103.906和1119.905分别为[M+Na+]和[M+K+]，继而推测[M+H+]是1081，该物质分子量为1080，还未查询到文献中该分子量的物质报道，因此可能是一种新的脂肽。而1089.862与1103.906相差一个亚甲基，应为[M+Na+]离子峰，继而推测[M+H+]是1067，该物质分子量为1066，属于分子量为1080物质的同系物，还未查询到文献有该分子量物质的报道，因此可能是一种新的脂肽。

图3 菌株JK19发酵上清液中脂肽粗提液MALDI-TOF-MS图谱Fig.3 MALDI-TOF-MS pattern of lipopeptide crude extract from fermentation supernatant of strain JK19

2.4 菌株JK19发酵上清液中易挥发性物质成分及含量

通过GC/MS-MS检测获得总离子流图（图4），通过面积归一法测得相对含量，JK19在最适发酵培养基中易挥发性物质及含量情况（表1）：2-甲基丁酸（24.05%）；环（脯氨酸-亮氨酸）二肽（21%）；3-甲基丁酸（20.29%）；六氢-3-（苯基甲基）吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮，即环（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽（8.74%）；环（L-脯-L-缬）二肽（7.97%）；六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮（6.31%）；2,2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.63%）；环（亮氨酸-亮氨酸）二肽（3.99%）；3-甲基-1,4-二氮杂二环[4.3.0]壬烷-2,5-二酮（3.02%）。

图4 菌株JK19最适发酵培养基中易挥发性物质总离子流图Fig.4 Total ion flow diagram of volatile matter in optimum fermentation medium of strain JK19

表1 菌株JK19最适发酵培养基中易挥发性物质保留时间、含量及名称Table 1 Retention time, content and name of volatile matter in optimal fermentation medium of strain JK19

3 讨论

贝莱斯芽胞杆菌因其能够产生多种次级代谢产物，并且具有广谱抑菌活性和促生长作用，被广泛应用于植物病害的生物防治[18]。芽胞杆菌菌液的稳定性不仅有利于工业化的大量生产，也能保证在田间施用时达到良好的防治效果[19]。本研究以对青枯病菌有较好的抑菌效果的贝莱斯芽胞杆菌JK19为研究材料，探究菌株 JK19发酵上清液稳定性及抑菌物质，为其作为微生物菌剂防治青枯病提供理论基础。研究结果表明，贝莱斯芽胞杆菌JK19菌株发酵上清液在超过温度80 ℃后，抑菌活性显著下降，但121 ℃下依然有抑菌效果。冯江鹏等[20]也研究发现高温（超过50 ℃）可降低贝莱斯芽胞杆菌JK3对草莓胶孢炭疽菌的抑菌活性，JK19菌株发酵上清液不耐强酸、强碱，适宜pH为4.0～10.0，这与赵雅等[14]研究结果相似；其耐受蛋白酶，这与孙平平等[21]研究结果一致，因此推测其主要抗菌活性成分不是蛋白质，结合项目前期PCR反应检测JK19基因组中有参与脂肽类抗生素合成相关的基因ituA、ituD、bamC、fenB、fenD、srfAB，菌株JK19抑制青枯病菌的抑菌物质是脂肽类物质。

近年来，基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术被用于脂肽鉴定中，它方便快捷，样品量少，灵敏度和准确性高，通过离子峰信号可以快速定性判断表面活性素、伊枯草菌素和丰源素类化合物[22]。刘佳欣等[16]利用MALDI-TOF-MS技术测定从海洋枯草芽胞杆菌中分离纯化出对革兰氏阴性海洋致病菌有较好抑制作用的物质，结果为C14～C15杆菌霉素D。本研究中对贝莱斯芽胞杆菌JK19的脂肽粗提物进行MALDI-TOF-MS检测，结果表明JK19脂肽粗提物中含杆菌霉素D和一种可能的新的脂肽。杆菌霉素D属于环状伊枯草菌素家族，被认为是由贝莱斯芽胞杆菌FZB42体外产生最强大的抗真菌代谢物质[23]，它对病原细菌也有较好的抑菌效果[24]。然而本研究中还有待进一步分离纯化脂肽粗提物，以确定主要抑菌活性物质是何种脂肽类型，为该脂肽在青枯病防治中的应用奠定基础。

环二肽是（2,5-哌嗪二酮）是最小的环肽，许多天然环二肽化合物都具有明确的生物活性，例如作为抗生素，苦味剂，植物生长抑制剂以及激素释放抑制剂等[25,26]。此外，环二肽能抑制多种农作物病原真菌，如尖孢镰孢Fusariumoxysporum[27]、毛霉Mucorramannianus[28]、链格孢Alternariaalternata[29]等。本研究中贝莱斯芽胞杆菌JK19发酵液中环二肽占比达41.7%，其中环（脯氨酸-亮氨酸）二肽占比达21%，环（苯丙氨酸-脯氨酸）占比达 8.74%。何培青等[29]研究发现环（脯氨酸-亮氨酸）二肽对辣椒疫霉Phytophthora capsici等5种作物病原真菌具有抑菌作用，最小抑制浓度为250～500 μg/mL。伯克霍尔德菌Burkholderia cepaciaCF-66产生的环（苯丙－脯）二肽对尖孢镰孢Fusariumoxysporum、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、盘核菌Sclerotiniasclerotiorum和新月弯孢霉Curvularialunata等农作物病原真菌均具有较强的抑制作用[30]。菌株JK19发酵液的环二肽含量较高，在番茄青枯病防治中有极大的潜力。

综上所述，贝莱斯芽胞杆菌JK19具有抑制青枯病菌生长的能力，可能与其产生脂肽、环二肽等多种抑菌活性物质有关。本研究仅对菌株 JK19发酵上清液体外防治番茄青枯病菌进行研究，后续将进一步纯化分离其代谢产物中的抑菌活性物质，并在体内进行验证，明确其抑菌机制，以期更好地利用拮抗菌株防控茄科类作物青枯病。