纳米二氧化钛神经毒性的研究进展*

田雨阳，王旖旎，王宇，马焜

（哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨150081）

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于1～100 nm，并作为基本单元构成的材料，具有体积效应、表面效应、量子尺寸效应、隧道效应和介电限域效应五大基本特征，由此也导致纳米材料在物理和化学方面具有其独特的性能[1]。近年来随着纳米技术基础理论和新材料应用的不断发展，纳米材料已经在传统材料、医疗器材、电子设备的行业得到了广泛的应用。纳米二氧化钛（titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）又称钛白粉，因其具有最佳白度、不透明度、光亮度、黏附能力强、熔点高、较好的抗菌性和紫外线掩蔽作用等特点，现已被广泛应用于涂料、造纸、印刷、化妆品和医疗等行业[2-3]。由于TiO2NPs 在人们生活中的应用范围不断扩大，其暴露机会也不断增加，其毒性和毒效应也逐渐引起了人们的关注。人们通过食入、吸入、皮肤渗透等途径长期接触TiO2NPs 颗粒的频率大大增高[4]，其可能成为危害人类健康的潜在环境污染物，其生物安全性亟待评估。目前对于TiO2NPs 生物毒性效应的研究主要集中在肺毒性、肝肾毒性、心血管毒性、皮肤毒性、生殖毒性及遗传突变等，其神经毒性研究仍处于起步阶段。本文根据以往的实验研究进展，结合国内外相关文献，总结TiO2NPs 的神经毒性及作用机制，探讨其对神经系统的潜在影响并做出展望，为TiO2NPs 在各领域中的安全应用提供参考。

1 TiO2 NPs的理化性质

TiO2NPs 是白色固体或粉末状物质，分子量79.9 Da，熔点高，主要包括锐钛矿型（Anatase，简称A 型）和金红石型（Rutile，简称R 型）等晶型[5-6]。TiO2NPs 直径<100 nm，具有很高的热稳定性、亲水性和化学稳定性，此外，还具有高折光性和高光活性，因此它既可吸收紫外线，也可反射、散射紫外线，有非常强的紫外线屏蔽作用。由于其具有纳米材料的基本特性，TiO2NPs 的某些物理化学性质与原型和微米TiO2均有所不同，纳米级的粒径使TiO2NPs 具有较大的表面积和较强的吸附能力[7]。通常TiO2NPs 被认为是无毒物质，但由于TiO2NPs 具有纳米材料的独特性质，仍可对生物体造成潜在危害。

2 TiO2 NPs进入中枢神经系统的途径

脑组织对外界刺激十分敏感，而且缺乏有效的防御机制，即使是进入微量的外界物质，都极易诱发神经系统应激反应，造成神经元损害和中枢神经系统的功能紊乱。因此，阐明TiO2NPs 对中枢神经系统的损伤机制迫在眉睫。粒径极小的TiO2NPs可以避开免疫系统的吞噬作用，主要经由呼吸道、胃肠道和皮肤渗透3 种方式进入血液系统，通过血脑屏障或鼻-脑通路沉积在脑组织或随血液循环到达中枢神经系统。进入中枢神经系统的TiO2NPs可破坏血脑屏障和神经细胞间的紧密连接，引起血脑屏障功能障碍和脑组织微环境的改变，从而导致中枢神经系统的功能性病变[8]。

2.1 胃肠道途径

TiO2NPs 具有的最佳白度特性使其作为白色素食品添加剂广泛用于各种食品着色。欧盟将其列为食品着色剂、食品添加剂、饮食辅料或用于食品包装。巧克力、口香糖、果冻、膨化食品、油炸食品和固体饮料中都含有高剂量的TiO2NPs，每单位含钛可达到0.01～1.00 mg，其中TiO2NPs颗粒含量达到27.7%～43.7%，并且95%在咀嚼时非常容易进入人体，胃肠道中的TiO2NPs 浓度可在24 h 内达到200 g/mL。根据最近数据表明，10 岁以下儿童和其他人群的膳食中TiO2NPs 的人体暴露量分别达到1～2 mg/（kg·d）和0.2～0.7 mg/（kg·d）[9]。因此经胃肠道成为了主要的暴露途径之一。经胃肠道摄入的TiO2NPs 直接被小肠和大肠的淋巴组织吸收，转到肠系膜进入血液循环，透过或破坏血脑屏障进入中枢神经系统。经胃肠道摄入TiO2NPs 吸收后容易通过肾脏排泄，脑部积累量较低，呈现TiO2NPs 粒径越大，脑内蓄积含量越高的趋势。

由于腹膜面积大，血管和淋巴管丰富，吸收能力强，药剂注射后可被迅速吸收，因此腹腔注射被当作为一种常用的给药方法。刘青等[10]给小鼠一次性腹腔注射不同剂量的TiO2NPs 颗粒溶液，14 d 后进行测定，结果小鼠肺及脑组织中的抗氧化酶和丙二醛浓度出现变化，说明TiO2NPs 对肝脏、脑和肺组织有一定损害作用,且不同组织器官的损伤程度不同。GERAETS 等[11]将5 种二氧化钛纳米颗粒（100 nm、101 nm、102 nm、103 nm 和104 nm）给予大鼠口服，并选择肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结作为钛分析的目标组织，结果发现肝和脾中的钛水平仅在某些大鼠中高于检测极限，肠系膜淋巴结中含量较低，表明TiO2NPs 在胃肠道中的吸收非常有限。经肠上皮细胞吸收的TiO2NPs 进入循环系统，在与相应蛋白质结合的过程中也可导致相关蛋白数目的增多[12]，后者也可能影响TiO2NPs 在人体内的分布。

2.2 呼吸道途径

TiO2NPs 因其催化作用和特殊的光效应而常被用于光涂料和漆料等领域，这也导致其可经呼吸道进入人体[13]。TiO2NPs 光催化消毒机和TiO2NPs喷液可用于空气净化、杀菌消毒或清除有机物污染时，空气中的TiO2NPs浓度可增加到0.7～16.0 μg/L[14]，大气中残存的TiO2NPs 可通过呼吸道吸入体内；化工行业在制造氧化钛过程中，职业人群长期暴露于含TiO2NPs的空气中，在其鼻咽、支气管和肺部可有明显的沉积，并且可通过嗅球转移到脑[15]。呼吸道是TiO2NPs进入机体的主要途径，其可由鼻咽部进入呼吸系统，穿透呼吸道表皮细胞进入细胞质，随后直接进入血液循环系统或间接经过淋巴系统分布全身，穿过血脑屏障进入中枢；或穿过鼻黏膜被嗅觉神经和感觉神经末梢摄取，进入嗅球沿神经转运入脑[16]。由于粒径较小，生物活性较高，所以可以以简单扩散等形式通过气-血屏障，沉积在肺泡组织和毛细血管处。OBERDORSTER 等[15]使用粒径为20 nm 和200 nm 的TiO2NPs 对大鼠进行亚慢性吸入实验，结果两组大鼠的下呼吸道均有TiO2NPs 沉积，且20 nm组的沉积时间更长，引起的炎症反应也更严重，说明粒径大小可影响沉积和损害程度。此外，TiO2NPs 也可经嗅神经转移进入脑部并蓄积。ZHANG等[16]将雌性小鼠每隔1 天鼻内滴注4 种不同类型的TiO2NPs 颗粒，每次30 d，结果发现鼻内滴注亲水性TiO2NPs 后，小鼠大脑皮层和纹状体中钛含量显著增加，大脑皮层神经元发生显著变化。

2.3 皮肤途径

由于TiO2NPs 具有优异的稳定性、低腐蚀性和抗紫外线等特点，被广泛用于化妆品[17]。将TiO2NPs 作为防晒成分添加到防晒霜中，可有效提高防晒指数，降低紫外线对皮肤的刺激作用，TiO2NPs可经皮吸收蓄积到角质层和表皮[18]。经皮肤接触的TiO2NPs 可能以渗透形式沉积在皮肤角质层和真皮层，TiO2NPs 可被皮肤局部淋巴结或被真皮层的感觉神经末梢摄取，并沿神经转运至中枢。但目前TiO2NPs 是否可以经过皮肤进入人体并造成损害尚不确定。TiO2NPs 曾普遍被认为只会沉积在角质层最外层，不会渗入深层皮肤。但仍有少数实验证实TiO2NPs 可渗透入深层皮肤。WU 等[19]在猪耳上局部施用30 d 的TiO2NPs，发现其可以穿透角质层并到达表皮深层；同时无毛小鼠皮肤在接触TiO2NPs 60 d 后，TiO2NPs 可穿透皮肤到达不同组织，并诱发多种病理性病变。

3 TiO2 NPs的神经毒性

近年来，许多研究证实TiO2NPs 可透过肺血屏障、血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等生物屏障，进入肺、脑、肾、肝等脏器，影响其生物学功能。TiO2NPs 因其特殊的物理化学特性和生物学惰性，具有强大的组织细胞穿透能力、氧化能力和催化能力。大鼠经口灌胃或鼻腔滴注方式进行TiO2NPs 染毒后，TiO2NPs 进入大鼠脑组织后可增强嗅球和海马等区域氧化应激反应，抑制神经递质的释放，减弱大鼠的空间记忆能力和学习能力[20]。此外，在妊娠期小鼠腹腔注射TiO2NPs，会在胎盘子代大鼠的肝脏和脑内出现，而非纳米级的TiO2颗粒并未引起这些症状。脑组织对外界刺激十分敏感，而且缺乏有效的防御机制，TiO2NPs 可损伤血脑屏障细胞和神经细胞间的紧密连接，引发血脑屏障功能障碍和脑组织微环境的改变，导致中枢神经系统的功能性改变。TiO2NPs 在脑内蓄积可引起神经毒性，主要通过诱发炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡和信号通路的异常激活导致中枢神经系统功能紊乱，但具体机制尚未明确。大量的动物和细胞实验证明TiO2NPs 颗粒对中枢神经系统具有潜在的神经毒性[21]。

3.1 中枢神经递质紊乱

TiO2NPs 可以改变血脑屏障的通透性，使脑内多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺及乙酰胆碱等神经递质的分泌水平和代谢酶活性明显下降；纹状体、黑质及海马区钛含量显著升高；神经元出现空泡、变性和死亡，神经胶质细胞异常增殖，组织出血和坏死等[22]。

3.2 氧化应激

目前，已有许多研究表明TiO2NPs 可对人体和其他生物产生明显的神经毒性作用，并影响相应神经功能、学习能力。TiO2NPs 蓄积会激活神经细胞内的氧化应激反应，活性氧（reactive oxygen species,ROS）和脂质过氧化物大量释放，破坏生物膜脂质、蛋白质和DNA 等大分子物质，导致线粒体和泛素-蛋白酶体系统的功能障碍，神经元内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）异常聚集，抑制神经细胞增殖，发生细胞周期阻滞和细胞凋亡[23]。郭晴等[17]将56 只小鼠经皮肤暴露途径连续42 d 暴露在8 组不同剂量的TiO2NPs 中，结果表明TiO2NPs可以经皮肤进入血液，并通过血脑屏障对大脑造成损伤。COCCINI 等[24]的研究证实短期暴露于低剂量（0.1～1.5 mg/mL）的TiO2NPs 即可对人脑SH-SY5Y细胞和D384 细胞系造成损害。LIU 等[18]通过测试不同大小的TiO2NPs 在体内外对大鼠星形胶质细胞存活率的抑制作用，发现TiO2NPs 可导致细胞形态结构发生明显变化，脑组织发生坏死。HU 等[25]发现TiO2NPs 可能在斑马鱼幼虫的大脑中积累，引起体内和体外多巴胺能神经元的丢失，对帕金森病的发生具有潜在影响。TiO2NPs 也可沉积在生物的海马体部，对学习和记忆能力造成影响。盛蕾[22]以具有发育特性的大鼠原代海马神经元细胞作为模型，用不同浓度（5 μg/mL、15 μg/mL 和30 μg/mL）的TiO2NPs（锐钛型，5 nm）处理细胞24 h，TiO2NPs 可以抑制原代海马神经元细胞质和细胞核，抑制树突发育。王文斌[21]将50 只SPF 级健康雄性大鼠分为5 组，分别以蒸馏水，62.5 mg/kg、125 mg/kg、250 mg/kg TiO2NPs 和250 mg/kg普通粒径TiO2进行灌胃染毒，在实验结束前6 d，利用Morris 水迷宫测定大鼠的学习记忆能力，并在实验结束时每组随机选2 只大鼠做常规病理切片，结果发现TiO2NPs 可进入大鼠血液及海马组织中并产生蓄积，并使大鼠空间学习记忆能力下降，造成大鼠脑皮层和海马组织损伤，诱导大鼠脑皮层和海马组织神经细胞凋亡。PEREZ-ARIZTI 等[2]用H2DCFDA 氧化法研究TiO2NPs 颗粒对大鼠星形胶质细胞的强氧化应激作用，流式细胞分析仪显示，与未暴露的细胞比较，ROS 在短时间（2 h、4 h 和6 h）内增加，而在TiO2NPs 暴露24 h 和48 h 后，ROS 的增加量更多。HE 等[26]发现抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸可显著降低小鼠海马神经元HT22 细胞中TiO2NPs 诱导的内质网应激，其特征在于葡萄糖调节蛋白78（GRP78）的下调和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）的裂解，表明氧化应激参与了TiO2NPs 诱导的内质网应激。KRAWCZYNSKA 等[27]发现TiO2NPs 可以降低芳香化酶基因的表达，降低谷胱甘肽过氧化物酶和还原酶的活性，产生氧化应激。VALENTINI 等[28]通过使用靶向脂质过氧化的抗4-羟基壬醛抗体进行评估，发现海马体、小脑和室管膜下区域是TiO2NPs 重要的氧化应激部位。见表1。

表1 TiO2 NPs引起的脑组织氧化应激反应致神经毒性

3.3 炎症反应

炎症反应是TiO2NPs 引起神经毒性的主要机制之一。TiO2NPs 可诱发中枢免疫调节，刺激TNF-α、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β等炎症介质的释放，上调趋化因子如主要组织相容性复合体、单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎症蛋白-2等表达，加速诱导神经细胞凋亡[21]。GRISSA等[29]每天对大鼠灌胃50 mg/（kg·BW）、100 mg/（kg·BW）和200 mg/（kg·BW）锐钛矿型TiO2NP（5～10 nm）60 d后，通过评估大脑的系数、乙酰胆碱酯酶（AChE）活性、IL-6 和神经胶质纤维酸性蛋白的表达以量化脑损伤，结果表明，与对照相比，高剂量锐钛矿型TiO2NPs 可以导致AChE 活性下调，血浆IL-6 水平升高，诱导神经损伤。SHIN 等[30]对经脂多糖处理30 min 后的雄性C57BL/6 小鼠腹膜内注射超细（21 nm）TiO2NPs，结果显示小胶质细胞活性增加，促炎细胞因子IL-1 和TNF-α 的mRNA 和蛋白水平显著提高，表明TiO2NPs 可通过增强小胶质细胞活化来促进神经炎症反应。除此之外，TiO2NPs 在进入中枢神经系统之后，还可对血脑屏障造成损伤，使血液中的分子和物质经通透性改变的血管壁进入脑组织，促进炎症发生。

3.4 细胞凋亡

LIU 等[31]将PC12 细胞分别暴露于TiO2NPs（10 g/mL 和50 g/mL）24 h 后，通过流式细胞术检测PC12 细胞的凋亡，结果TiO2NPs 以剂量依赖的方式诱导PC12 细胞的凋亡，但用ROS 清除剂预处理可以抑制TiO2NPs 诱导的PC12 细胞的凋亡，说明TiO2NPs 是通过氧化应激的方式引起细胞凋亡。TiO2NPs 诱导神经炎症信号，激活炎症级联反应和丝裂原活化蛋白激酶、蛋白酪氨酸激酶及P53 等信号通路， 诱导凋亡相关基因NF- κB、Bax、Caspase-3等异常表达[32-33]。WU 等[34]和冒志磊[35]将PC12 细胞暴露于TiO2NPs 颗粒中，通过Western blotting 和Caspase 3 对c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、P53、P21、Bax 和Bcl-2 进行分析，结果表明TiO2NPs 可通过ROS 和JNK/P53 介导的凋亡作用诱导神经元损伤，并通过激活P53/P21 途径引起细胞在G2/M 期发生阻滞。

4 结论

TiO2NPs 作为最有潜力的新型纳米材料之一，在生活的各个方面逐渐得到了广泛的应用，并且有着可观的发展前景。TiO2 NPs 对人体可能具有潜在的遗传毒性和神经毒性，其中神经毒性主要表现为海马体受损，小脑病变等引起的学习、记忆能力减退和阿尔兹海默病。TiO2NPs 诱导的神经毒性会加重脑内的免疫炎症反应和氧化应激，破坏血脑屏障的完整性，损伤脑内神经元，引起中枢神经系统损伤。然而，现有的实验结果和证据均不能证明TiO2NPs 会对人体产生严重影响，由于缺乏可靠的生物安全模型，同时其物理化学性质和引起影响的强弱与粒径大小和颗粒数目有很大关系，TiO2NPs的生物安全性值得进一步研究和讨论。随着TiO2NPs 应用的加快，对其进行安全性评价的需求也迫在眉睫，从而为生命健康提供保障，为材料正确合理使用提供依据。