大肠湿热型无蒂锯齿状腺瘤/息肉与P16、β-catenin表达关系的研究

余凤莲，付肖岩，林巧云，林建龙，王 薇，钟国栋，陈小玲，

（1.福建中医药大学附属第三人民医院，福建 福州 350108；2.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见三大恶性肿瘤之一，病死率居第二位［1］，在我国发病率、病死率在持续增加［2］。无蒂锯齿状腺瘤/息肉（serrated adenoma/polyp，SSA/P）作为癌前病变之一，其可通过锯齿状途径发展为CRC［3-4］，且当SSA/P伴异型增生（serrated adenoma/polyp-cytologic dysplasia，SSA/P-CD）时，向CRC发展的时间将会明显缩短［5］，因此早期诊治SSA/P对预防和减缓该病变发展至CRC至关重要。锯齿状病变癌变通路通常以CpG岛甲基化为主要表型，伴随基因突变和Wnt信号通路异常等，因此遗传因素是导致CRC发生的重要因素，而在SSA/P癌变过程中多肿瘤抑制因子1（multiple tumor suppressor 1，P16）、β-连环蛋白（βcatenin）主要参与其中［6-7］。P16是一种抑癌基因，当基因突变和缺失时，细胞转录异常引起细胞无限自主增殖，导致肿瘤发生［8］。P16基因上的CpG岛被高甲基化修饰后P16将失活，从而增加了锯齿状腺瘤癌变的可能性。β-catenin是Wnt信号通路中起到关键作用的分子，是拥有多种不同功能的一种蛋白质，主要参与同一类型细胞之间的黏附和作为信号转导分子及基因的表达，在通路异常激活后促进肿瘤发生。研究发现，β-catenin的异常表达与锯齿状腺瘤癌变具有较大相关性，β-catenin表达异常随着大肠锯齿状腺瘤的异型增生程度加重而变化［9］。前期研究和文献报道发现，在临床中大肠腺瘤中医证型以大肠湿热证和脾胃虚弱证居多［10-13］。本研究检测大肠湿热型SSA/P中P16、βcatenin的表达水平，并与脾胃虚弱型、健康人群进行比较，观察3组表达有无差异，以初步探讨大肠湿热型无蒂锯齿状腺瘤/息肉与P16、β-catenin表达的关系。

1 资料与方法

1.1 西医诊断标准 SSA/P和SSA/P-CD诊断标准根据WHO提出的《WHO消化系统肿瘤分类》［14］中大肠锯齿状病变的组织学和分子病理学特征诊断。

1.2 中医辨证标准 参照《24个专业105个病种中医诊疗方案》［15］中大肠息肉中医诊疗方案中大肠湿热证及脾胃虚弱证的辨证标准。

1.3 纳入标准 ①符合SSA/P和SSA/P-CD诊断标准者；②年龄18～65岁，不限制性别和种族；③自愿加入本研究，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①妊娠及哺乳期妇女；②病理诊断非SSA/P及SSA/P-CD者；③合并其他腺瘤者；④中医辨证有兼证者；⑤合并有肠炎、肠溃疡、消化道肿瘤等疾病；⑥合并有心、脑、肾、肝和血液系统方面等重大疾病，并（或）精神病；⑦不能完成完整的结肠检查。

1.5 一般资料 选取2020年2月—2021年2月于福建中医药大学附属第二人民医院脾胃科住院及门诊就诊的SSA/P患者60例，中医辨证符合大肠湿热证者纳入大肠湿热证组，符合脾胃虚弱证者纳入脾胃虚弱证组，其中大肠湿热证30例为大肠湿热证组，脾胃虚弱证30例为脾胃虚弱证组。另选我院健康体检者的大肠正常黏膜组织20例作为正常对照组。大肠湿热证组中SSA/P不伴异型增生（单纯SSA/P）12例，SSA/P-CD 18例；脾胃虚弱证组中单纯SSA/P 19例，SSA/P-CD 11例。3组性别、年龄及有无伴异型增生的情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 3组一般资料比较（±s）

表1 3组一般资料比较（±s）

组别正常对照组大肠湿热证组脾胃虚弱证组例数20 30 30男12 18 16女8 12 14年龄/岁52.95±7.74 53.55±8.45 51.17±9.11单纯SSA/P 0 12 19 SSA/P-CD 0 18 11

1.6 检测指标及方法 采用免疫组织化学法检测P16、β-catenin的表达情况。P16的阳性表现为胞核或部分胞浆染色为棕黄色者，在×200的高倍镜下每张玻片随机选择5个视野统计阳性细胞数，按阳性细胞占比率和染色强度进行计分。参照BARNES等［16］半定量法进行评级，即阳性细胞所占比例及显色深度分级乘积作为评分标准再进行评级。β-catenin蛋白的结果判定参考MARUYAMA等［17］方法，镜下见胞膜阳性率大于70%为正常，小于70%为表达减弱或缺失；胞质或胞核阳性率大于10%为异位表达；表达减弱或缺失及异位表达均为异常表达。

1.7 统计学方法 采用统计软件SPSS24.0进行统计学分析。计量资料经W检验（Shapiro-Wilk法）符合正态分布以（±s）表示，采用t检验分析；计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 3组P16阳性表达水平分布情况 见表2。

表2 3组P16阳性表达水平分布情况

2.2 3组β-catenin阳性表达水平分布情况 见表3。

表3 3组β-catenin阳性表达水平分布情况

2.3 2组不同病理分类中P16表达水平分布情况见表4。

表4 2组不同病理分类中P16表达水平分布情况

2.4 2组不同病理分类中β-catenin表达水平分布情况 见表5。

表5 2组不同病理分类中β-catenin表达水平分布情况

3 讨论

中医学认为，大肠息肉的致病因素与湿热病邪有非常大的关联，通常认为气候环境、地理位置、饮食习惯、外感湿邪与内湿等因素均易导致湿热证的发生，从而引起肿瘤易感性增加。分子机制研究表明，湿热证候可通过炎症、免疫、代谢、胃肠道微生态等环节塑造肿瘤免疫微环境的形成，促进肠道肿瘤发生和转移。福州位于东南沿海，气候潮湿，易感湿热之邪，加之饮食习惯，口味偏甘，嗜食肥腻及烟酒之品，极易损伤脾胃、肠道。脾胃即伤则脏腑失和，湿邪内生，湿重浊而趋下，下犯肠腑，湿与热搏结于肠道导致大肠腺瘤发病，故本病多见大肠湿热证。谢丹枫等［18］研究提出湿热可促进肿瘤发生发展，在基因水平上影响机体免疫和炎症反应，修饰肿瘤微环境。P16和β-catenin作为肿瘤发生发展过程中的重要指标，P16蛋白也称细胞周期调控蛋白，其一旦发生缺失或突变，将引起恶性肿瘤发生，目前已发现它具有较高的缺失或突变频率，主要表现在肠癌、食管癌、胃癌、肺癌、宫颈癌和卵巢癌以及其他恶性肿瘤中［19-23］。β-catenin则是Wnt经典信号通路上的关键调控因子，如果出现调节异常，则会导致通路异常激活，β-catenin蛋白的表达水平随之上升，从而导致肿瘤的发生［24］。

本研究结果显示，P16蛋白的阳性表达率在大肠湿热证组、脾胃虚弱证组中均低于正常对照组，P16蛋白随着病变的发展，表达呈下调状态，提示P16调控细胞周期并维持细胞有序增殖，推测P16基因失活使细胞生长失去控制，可能是导致大肠湿热型SSA/P发生的重要因素，并在SSA/P病变通路中起推动作用。β-catenin蛋白阳性表达率在大肠湿热证组、脾胃虚弱证组中均显著高于正常对照组，提示β-catenin作为Wnt信号通路的关键分子，在转录黏附调剂机制中起着分子开关的作用，推测β-catenin异位表达增加使细胞黏附功能降低，参与SSA/P的形成。提示P16、β-catenin表达水平的变化可能在SSA/P的早期发生起作用。

单纯SSA/P中P16蛋白和β-catenin在大肠湿热证组、脾胃虚弱证组中阳性表达率差异无统计学意义；在SSA/P-CD中，P16蛋白和β-catenin在大肠湿热证组的阳性率明显较脾胃虚弱证降低和提高，提示SSA/P-CD中P16的低表达和β-catenin高表达可能与大肠湿热证具有一定关系。P16低表达和β-catenin的高表达均参与了腺瘤的发生及癌变［6-7，9，25］，并在SSA/P到SSA/P-CD的发展进程中起重要作用。本研究提示，SSA/P伴有异型增生者，大肠湿热证是一个应引起重视的证型，充分将西医的病与中医的证相结合，提高对临床疾病的综合判断。

本研究发现在大肠湿热型SSA/P-CD中，P16低表达和β-catenin高表达，提示SSA/P病变过程中大肠湿热证的恶变可能性更高，针对大肠湿热型的SSA/P内镜下应积极治疗和密切随访，但能否通过清热化湿中医干预治疗，有待进一步研究。