基于代谢组学的‘永春佛手’乌龙茶化学成分解析

彭佳堃，戴伟东，颜涌泉，张悦，陈丹，董明花，吕美玲，林智

基于代谢组学的‘永春佛手’乌龙茶化学成分解析

1中国农业科学院茶叶研究所/农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，杭州 310008；2中国农业科学院研究生院，北京 100081；3永春县农业农村局，福建泉州 362600；4安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102

【】不同茶树品种制作的乌龙茶风味品质和内含成分具有明显差异。本研究结合非靶向代谢组学、化合物定量分析、多元统计学等方法比较‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶的化学成分差异，分析‘永春佛手’乌龙茶的特征性化学成分，并探讨茶树品种对乌龙茶内含成分和感官品质的影响。以‘永春佛手’品种为主要研究对象，‘铁观音’和‘水仙’品种为对照，三者均加工制成清香型、浓香型和陈香型乌龙茶，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）进行非靶向代谢组学分析，对不同品种乌龙茶的差异化合物进行鉴定和筛选，并采用超高效液相色谱仪、氨基酸分析仪和超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Orbitrap-MS）对茶叶中主要化学成分和不同品种乌龙茶间差异化合物进行定量分析。相比于同一香型的对照品种乌龙茶，‘永春佛手’具有相对较高的氨基酸总量和茶氨酸含量，儿茶素类化合物总量和咖啡碱含量在清香型和浓香型的不同品种间无显著差异，在陈香型中均以‘永春佛手’乌龙茶含量最高，没食子酸含量在3种香型中均呈现‘水仙’>‘永春佛手’>‘铁观音’。代谢组学结合多变量统计表明，不同品种制成的乌龙茶化合物表型具有明显差异。清香型、浓香型和陈香型乌龙茶中，‘永春佛手’与对照品种乌龙茶间的差异化合物分别为50、59、47个，其中共同差异化合物有23个，包括14个黄酮（醇）糖苷、5个儿茶素类化合物及其衍生物、1个脂类、1个生物碱、1个有机酸和1个氨基酸类化合物。进一步对茶叶中常见的20个黄酮（醇）糖苷组分进行定量分析，结果显示‘永春佛手’乌龙茶中14个黄酮（醇）糖苷组分的含量显著高于对照品种乌龙茶，其含量是相同香型‘铁观音’品种乌龙茶的1.4—14.6倍，是‘水仙’品种乌龙茶的1.3—18.0倍。在定量的4类黄酮（醇）糖苷中，槲皮素糖苷均为主要的黄酮（醇）糖苷组分，含量高于山柰酚糖苷、杨梅素糖苷和芹菜素糖苷。感官审评分析表明较高含量的黄酮（醇）糖苷并未显著增强茶汤的涩味。代谢组学方法可以有效地对不同品种制作的乌龙茶进行化合物表征。‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’按照相同工艺制成的乌龙茶具有较为明显的化学成分差异，其中黄酮（醇）糖苷类化合物差异最为显著，具有较高含量的黄酮（醇）糖苷类成分是‘永春佛手’乌龙茶在化学成分方面的一个重要特征。黄酮（醇）糖苷类成分有望作为判别指标用于乌龙茶制作品种的判别。

乌龙茶；品种特征成分；代谢组学；液质联用；黄酮（醇）糖苷

0 引言

【研究意义】‘永春佛手’茶（YCFS）是以福建省永春县当地茶树品种‘佛手’（(L.) O. Kuntze cv. Foshou）的鲜叶为原料制成，其叶片与‘佛手柑’（L. var.Swingle）的叶子相似，同时其干茶冲泡后呈现类似佛手柑的果香，所以被称为‘佛手’，是永春县地理标志产品[1]。根据国家标准GB/T 30357.7—2017 “乌龙茶第七部分：佛手”中毛茶加工工艺的不同，‘永春佛手’乌龙茶可分为清香型、浓香型和陈香型。清香型‘永春佛手’乌龙茶干茶乌绿润，香气清高，滋味醇厚甘爽，香橼香明显；浓香型干茶青褐润，有熟果香，滋味醇厚回甘；陈香型干茶乌褐润，陈香浓郁，滋味爽滑回甘[2]。‘铁观音’乌龙茶也有3种香型之分[3]，不同品种茶树制成的同一香型乌龙茶具有相似之处，同时还有品种特色，如清香型铁观音干茶砂绿，香气清高，但是其滋味和香型有别于清香型‘永春佛手’乌龙茶，滋味上具有独特的“音韵”，香气无佛手的香橼果香。不同品种制成的乌龙茶具有明显的品种特征，其化学成分的差异起到关键作用。本研究以不同品种茶树鲜叶分别制成清香型、浓香型、陈香型乌龙茶，从内含成分对茶叶生化特征进行解析和比较，从而探究不同品种茶树制成的乌龙茶化学成分差异和品质形成机理，为乌龙茶风味的品种独特性提供理论基础。【前人研究进展】多酚类、氨基酸类、糖类、生物碱类等内含成分是构成茶叶风味品质的物质基础[4]。相关研究表明儿茶素总量[5]、儿茶素衍生物[6]、脂肪酸[7]等物质在不同茶树品种鲜叶中的含量具有明显差异。对武夷山14个适制乌龙茶的茶树品种鲜叶研究表明，儿茶素类和黄酮（醇）糖苷等成分被认为有望作为茶叶品种鉴别的关键代谢物[8]。这些内含成分的差异最终导致不同品种鲜叶加工而成的茶叶具有不同的风味品质[9]和保健功效[10]。对11个茶树品种制成的红茶分析发现，‘英红1号’和‘英红9号’品种制成的红茶具有较高含量的儿茶素类、儿茶素衍生物、酚酸，而黄酮糖苷、游离糖和氨基酸含量较低，其滋味、香气和汤色的评分均高于其他品种[11]。不同茶树品种的鲜叶根据相同工艺加工成绿茶[12]、黑茶[13]、白茶[14]等均会呈现不同的品质特征。目前，通过代谢组学对不同茶树品种制成的乌龙茶进行全面分析的文献报道较少。代谢组学以样品中的小分子代谢产物为研究对象，能够全面、高效地对生物体内的代谢产物进行表征，已广泛应用于茶叶生长发育[15]、采收[16-17]、加工[18-19]和贮藏[20-21]等过程中化学成分的检测和鉴定，极大地促进了茶叶的品质化学研究。【本研究切入点】目前对于乌龙茶的研究主要集中在‘铁观音’[17,21]、‘大红袍’‘肉桂’[8]等较为知名的品种；永春‘佛手’是永春县主要栽培品种，同时也是闽南代表性的一类乌龙茶，但其化学成分和品质特征研究较少。代谢组学方法结合化合物绝对定量能够全面、准确地对茶叶内含物质进行解析并筛选特征化合物。【拟解决的关键问题】本研究以‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’品种为研究对象，制成不同香型的乌龙茶，开展主要化学成分定量分析和代谢组学检测，结合化学计量学筛选差异成分，阐明‘永春佛手’相较于‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶的化学成分特征，探究茶树品种对乌龙茶品质的影响。

1 材料与方法

试验于2020年在中国农业科学院茶叶研究所和北京安捷伦科技有限公司进行。

1.1 试验材料

取福建省永春县同一产地的‘永春佛手’（YCFS）、‘铁观音’（TGY）（cv. Tieguanyin）和‘水仙’（SX）（cv. Shuixian）品种鲜叶，按照清香型和浓香型乌龙茶工艺进行加工，并搜集3个品种的陈香型乌龙茶。3种香型乌龙茶均经历晒青、做青（凉青和摇青）、杀青、包揉与烘焙的加工步骤。清香型乌龙茶做青程度较轻，通过较低温（80—90℃）烘焙而成；浓香型乌龙茶做青程度高于清香型乌龙茶，并经过高温（90—100℃）焙火而成；陈香型乌龙茶由对应品种的清香型乌龙茶贮藏5年以上形成。样品具体包括：清香型‘永春佛手’乌龙茶6个样品、作为对照的清香型‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶各1个；浓香型‘永春佛手’乌龙茶6个样品、作为对照的浓香型‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶各1个；陈香型‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶样品各1个，贮藏时间均为10年。以上共19个样品，每个样品取3个平行重复。

1.2 主要试验仪器和试剂

仪器：氨基酸分析仪（S-433D，Sykam，德国）；超高效液相色谱（Acquity H-Class，Waters，英国）；超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLC- Q-TOF/MS，Agilent Tech.，美国）；紫外分光光度计（UV-3600，Shimadzu，日本）；超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Orbitrap-MS，ThermoFisher，美国）。

试剂：氨基酸、儿茶素类化合物、没食子酸、槲皮素3-O-葡萄糖苷（quercetin 3-O-glucoside）、槲皮素 3-O-半乳糖苷（quercetin 3-O-galactoside）、山柰酚 3-O-半乳糖苷（kaempferol 3-O-galactoside）、山柰酚 3-O-芸香糖苷（kaempferol 3-O-rutinoside）、牡荆素（vitexin）、异牡荆素（isovitexin）、杨梅素 3-O-半乳糖苷（myricetin 3-O-galactoside）标准品和色谱级乙腈、甲醇购自Sigma-Aldrich；咖啡碱购自Enzo Life Sciences；甲酸（>99.0%）购自TCI公司；AlCl3购自美兴化工股份有限公司；茶氨酸、芦丁、槲皮素 3-O芸香糖苷（quercetin 3-O-rutinoside）购自百灵威公司；去离子水为Milli-Q超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 氨基酸、儿茶素类、咖啡碱和没食子酸含量测定 游离氨基酸组分使用氨基酸分析仪检测，参考Yang等[22]的处理方法，在Na+型磺酸基强酸阳离子交换树脂上分离，流速为0.25 mL·min-1。波长设置为570和440 nm，柱温40℃，通过与氨基酸标准溶液比较峰保留时间来定性，用外标法测定浓度。参考课题组前期已建立的方法[15]，采用Acquity H-Class测定儿茶素类化合物、咖啡碱和没食子酸。色谱柱为BEH C18 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，英国），柱温35℃。采用二元流动相洗脱，流速为0.35 mL·min-1。A相为含0.1%甲酸的水溶液，B相为纯甲醇。梯度洗脱方法：0 min，3% B；3 min，8% B；7.5 min，20% B；11 min，20% B；13 min，60% B；14.5 min，60% B；15 min，3% B；19 min，3% B。进样量5 μL。采用外标法测定儿茶素类化合物、咖啡碱和没食子酸含量。

1.3.2 代谢组学分析 参考课题组前期已建立的方法[20]，采用UHPLC-Q-TOF/MS进行茶叶代谢组学分析。色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18 column（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，Agilent Tech.，美国），柱温40℃。采用二元流动相洗脱，流速为0.4 mL·min-1。A相为含0.1%甲酸的水溶液，B相为纯甲醇。梯度洗脱方法：0 min，5% B；3 min，10% B；4 min，15% B；7 min，30% B；16 min，50% B；20 min，95% B；22 min，95% B；22.5 min，5% B；26 min，5% B。进样量4 μL。质谱采用双射流电喷雾离子源，正离子模式扫描；毛细管电压为4 000 V；干燥气温度325℃，流速10 L·min-1；雾化气压强40 psi；鞘气温度325℃，流速11 L·min-1；质谱扫描范围为m/z 100—1 000。

1.3.3 总黄酮和黄酮（醇）糖苷组分含量测定 采用三氯化铝法测定总黄酮含量，参照陈勤操等[15]的方法，稍有改动：0.3 g茶样使用25 mL的95%乙醇提取后，4 000 r/min离心10 min，吸取0.5 mL上清液于25 mL比色管中，加入1 mL的10% AlCl3溶液和4 mL pH 5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，定容至25 mL，摇匀反应30 min，于415 nm波长下用10 mm比色皿测定吸光度。

采用UHPLC-Q-Orbitrap-MS测定黄酮（醇）糖苷组分含量。色谱柱为HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，英国），柱温40℃。采用二元流动相洗脱，流速为0.4 mL·min-1。A相为含0.1%甲酸的水溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱方法：0 min，2% B；0.5 min，2% B；10 min，15% B；18 min，40% B；20 min，90% B；20.9 min，90% B；21 min，2% B；25 min，2% B。进样量3 μL。质谱使用电喷雾离子化（ESI），在正离子模式下扫描；喷雾电压3.5 kV；离子传输管温度300℃；S-lens RF水平50；鞘气流速45 L·min-1；辅助气加热温度350℃，流速10 L·min-1；质谱扫描范围为m/z 80—1 200。采用外标法对乌龙茶中黄酮（醇）糖苷组分含量进行定量。

1.4 数据处理

UHPLC-Q-TOF/MS得到的原始谱图使用Profinder B.08.00 software和Mass Profiler Professional software 13.0（Agilent Tech.，Santa Clara，美国）分别进行峰提取和峰匹配。主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）使用Simca 14.1（Umetrics AB，Umeå，瑞典）。独立样本T检验和非参数检验（Kruskal- Wallis H test）使用IBM SPSS Statistics software 25（美国），<0.05认为有显著差异。UHPLC-Q-Orbitrap-MS采集的数据使用Xcalibur 4.2（ThermoFisher，美国）进行定性和定量分析。

2 结果

2.1 ‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’品种乌龙茶中主要生化成分差异

2.1.1 游离氨基酸组分差异 清香型乌龙茶中，‘永春佛手’的天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸含量显著高于‘铁观音’，仅-氨基丁酸含量同时高于‘铁观音’和‘水仙’，分别是‘铁观音’‘水仙’乌龙茶的3.75倍和2倍；‘永春佛手’品种的茶氨酸含量（7.66 mg∙g-1）和氨基酸总量（13.82 mg·g-1）均高于‘铁观音’（4.96 mg·g-1、9.70 mg·g-1）和‘水仙’（5.45 mg·g-1、12.29 mg·g-1），但无统计学差异。浓香型‘永春佛手’对比浓香型‘铁观音’，其天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸含量较高，氨基酸总量在‘永春佛手’中含量较高但无统计学差异；浓香型‘水仙’乌龙茶多个氨基酸组分与氨基酸总量显著低于‘永春佛手’乌龙茶。在陈香型乌龙茶中，‘永春佛手’的茶氨酸含量显著高于‘铁观音’和‘水仙’，含量是两个对照品种的2—3倍；天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸和酪氨酸均在陈香型‘永春佛手’中含量最高，其氨基酸总量达到‘铁观音’和‘水仙’品种的2倍。

2.1.2 儿茶素组分、咖啡碱和没食子酸含量差异 3种香型的‘永春佛手’与对照品种之间儿茶素组分含量具有显著差异（表2）。清香型乌龙茶中，表儿茶素（EC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、儿茶素没食子酸酯（CG）在‘永春佛手’中的含量显著高于‘铁观音’和‘水仙’，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）在两个对照品种中的含量均高于‘永春佛手’乌龙茶，儿茶素总量在三者中无统计学显著差异。浓香型乌龙茶中，仅CG在‘永春佛手’中含量同时高于‘铁观音’和‘水仙’；在儿茶素总量上，‘永春佛手’（134.64 mg·g-1）高于‘水仙’（78.37 mg·g-1），与‘铁观音’（140.82 mg·g-1）无显著差异。陈香型乌龙茶中，酯型儿茶素（表儿茶素没食子酸酯ECG、CG、EGCG、GCG）总量和非酯型儿茶素（EC、儿茶素C、表没食子儿茶素EGC、没食子儿茶素GC）总量均在‘永春佛手’乌龙茶中含量最高，‘永春佛手’乌龙茶的儿茶素总量（103.13 mg·g-1）分别是‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶的1.47和1.58倍。‘永春佛手’乌龙茶的咖啡碱含量在清香型和浓香型乌龙茶中与对照品种无统计学差异，在陈香型乌龙茶中呈现较高含量。与对照品种相比，3种香型乌龙茶中没食子酸在‘永春佛手’乌龙茶中的含量均高于‘铁观音’，低于‘水仙’品种。

表1 不同品种制成的3种香型乌龙茶氨基酸含量

数据为平均值±标准差（清香型和浓香型‘永春佛手’茶：n=18；其他茶样：n=3）；不同小写字母表示‘永春佛手’与相同香型的对照品种（‘铁观音’和‘水仙’）间差异显著（<0.05，Duncan’s test）。下同

The data are mean value ± SD (Fresh-scent and strong-scent YCFS: n=18; others: n=3). Different letters indicate that there is significant difference between YCFS and the control cultivars (TGY and SX) of same scent type (＜0.05, Duncan’s test). The same as below

2.2 乌龙茶代谢组学分析

进一步利用UHPLC-Q-TOF/MS对3种香型的‘永春佛手’‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶进行代谢组学分析。检测的数据经过峰提取和匹配后，共得到3 311个化合物特征离子。根据上述化合物特征离子，在Simca 14.1软件中对不同类型茶样进行主成分分析（PCA）（图1-A）。PCA图可以初步了解不同样品间的总体化合物差异和重复样品的组内变异度大小，从图1-A可以看出同一香型的不同品种乌龙茶得到较好区分，说明不同品种茶树制成的乌龙茶具有明显的化合物差异。浓香型‘永春佛手’乌龙茶的组内变异度大于清香型‘永春佛手’乌龙茶；平行重复的3个样品组内变异度均较小。

对以上的特征离子进行化合物鉴定和差异化合物分析。根据课题组前期代谢组学分析和化合物鉴定方面的结果[16,22-25]，本研究共鉴定出159个化合物，包括10个生物碱、12个氨基酸、5个香气前体、14个二聚儿茶素、7个黄酮生物碱、12个黄烷醇、31个黄酮（醇）糖苷、40个脂类、6个有机酸、14个酚酸和8个其他物质。以清香型、浓香型和陈香型乌龙茶为分类对其进行PLS-DA分析，根据变量重要性投影（variable importance in project，VIP）大于1和具有统计学显著差异（Kruskal-Wallis H test，<0.05）的化合物进行筛选，最后清香型、浓香型和陈香型乌龙茶分别保留了50、59、47个差异化合物。对3种香型的差异化合物进行韦恩图分析（如图1-B所示），其中23个化合物在3种香型中均具有显著性差异，对其进行分类，其中差异个数最多的化合物是黄酮（醇）糖苷类，共有14个，分别为4个芹菜素糖苷（芹菜素6, 8-C-二葡萄糖苷、芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、异牡荆素、牡荆素）、4个槲皮素糖苷（槲皮素3-O-（3-p-香豆酰葡萄糖苷）、槲皮素3-O-葡萄糖酰芸香糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷）、4个山柰酚糖苷（2''-O-反式-对香豆酰紫云英苷、山柰酚3-O-葡萄糖酰芸香糖苷、山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-芸香糖苷）和2个杨梅素糖苷（杨梅素3-O-半乳糖苷、杨梅素3-O-葡萄糖苷）。

表2 不同品种制成的3种香型乌龙茶儿茶素、咖啡碱和没食子酸含量

A：永春佛手、铁观音、水仙3种香型乌龙茶的主成分分析得分图（R2X=0.337，Q2=0.286）（圆点表示永春佛手乌龙茶、正方形表示铁观音乌龙茶、三角形表示水仙乌龙茶；红色表示清香型乌龙茶、蓝色表示浓香型乌龙茶、绿色表示陈香型乌龙茶）；B：3个品种制成的3种香型乌龙茶差异化合物分析

对3个品种制成的清香型、浓香型和陈香型乌龙茶中的差异化合物峰面积数据归一化后进行热图分析，如图2所示。图2-A显示清香型乌龙茶中，具有差异的黄酮醇糖苷类化合物共有19个，其中除了山柰苷（kaempferitrin）在‘铁观音’和‘水仙’品种中的含量较高外，其他黄酮（醇）糖苷类化合物均在‘永春佛手’乌龙茶中的含量最高，包括上述14个在3种香型中同时具有差异的黄酮（醇）糖苷和槲皮素3-O-芸香糖苷（quercetin 3-O-rutinoside）、槲皮素二葡萄糖苷（quercetin 3, 4-O-diglucoside）、槲皮素3-O-半乳糖酰芸香糖苷（quercetin 3-O-galactosylrutinoside）、槲皮素3-O-（3-对香豆酰葡萄糖苷）（quercetin 3-O-（3-p- coumaroylglucoside））。近年来在年份茶中逐渐成为研究热门的黄酮生物碱（flavonoid alkaloids）[20,26-29]在清香型乌龙茶中检测到7个EPSF（N-ethyl-2- pyrrolidinone- substituted flavan-3-ols）组分，且均在‘水仙’品种中呈现较高含量。在清香型乌龙茶差异化合物的3个生物碱中，除磷酸胆碱（phosphocholine）在‘永春佛手’和‘水仙’中的含量较高外，胆碱（choline）和甘油磷酰胆碱（glycerophosphocholine）在‘永春佛手’中的平均含量高于两个对照品种。

图2-B显示浓香型‘永春佛手’品种内差异比较大，这可能是由于所采集的样品原料不同造成的影响。在浓香型乌龙茶中，脂类在‘永春佛手’品种中的平均含量较高，包括亚油酰基乙醇酰胺（linoleoyl ethanolamide）、磷脂酰乙醇胺（PE）、甘油二酯（DG）和多种溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）。具有统计学差异的黄酮（醇）糖苷类在浓香型乌龙茶中共有20个，其中山柰苷在浓香型‘铁观音’中呈现较高含量，其余19个黄酮（醇）糖苷组分均在浓香型‘永春佛手’中的含量较高，包括芹菜素 6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、山柰酚 3-O-半乳糖苷、山柰酚 3-O-香豆酰葡萄糖苷、槲皮素 3-O-芸香糖苷、山柰酚 3-O-半乳糖酰芸香糖苷和14个3种香型同时具有差异的黄酮（醇）糖苷。二聚儿茶素（原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1、表儿茶素-4-8-表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-4-8-表儿茶素没食子酸酯）在‘永春佛手’乌龙茶中的含量均高于两个对照品种。儿茶素组分中EGCG、EGC和EC在浓香型‘永春佛手’乌龙茶中的含量与‘铁观音’乌龙茶差异不明显，高于浓香型‘水仙’中的含量；‘永春佛手’中儿茶素C的平均含量高于‘铁观音’和‘水仙’品种，以上结果与上述超高效液相色谱测定的儿茶素绝对定量结果一致。4个在浓香型乌龙茶中具有显著差异的生物碱类化合物（胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酰胆碱、5'-甲基硫腺苷）均以‘永春佛手’中的含量最高。

图2-C显示在陈香型乌龙茶中，具有差异的18个黄酮（醇）糖苷，包括5个芹菜素糖苷（芹菜素6,8-C-二葡萄糖苷、芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷、异牡荆素、牡荆素）、5个山柰酚糖苷（2''-O-反式-对香豆酰紫云英苷、山柰酚3-O-葡萄糖酰芸香糖苷、山柰酚3-O-半乳糖苷、山柰酚3-O-葡萄糖苷、山柰酚3-O-芸香糖苷）、6个槲皮素糖苷（槲皮素3-O-（3-p-香豆酰葡萄糖苷）、槲皮素3-O-葡萄糖酰芸香糖苷、槲皮素3-O-半乳糖酰芸香糖苷、槲皮素3，4'-O-二葡萄糖糖苷、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-半乳糖苷）、2个杨梅素糖苷（杨梅素3-O-半乳糖苷、杨梅素3-O-葡萄糖苷），均在‘永春佛手’中含量最高。在陈香型乌龙茶中具有显著差异的生物碱类化合物有2个，为甘油磷酰胆碱和可可碱（theobromine），与其他香型乌龙茶中生物碱的结果相似，均为‘永春佛手’中的含量较高，说明生物碱也可能是‘永春佛手’茶与对照品种的关键差异化合物。热图中显示儿茶素组分EC、ECG、EGCG在‘永春佛手’乌龙茶中呈现较高含量，GCG、GC在‘水仙’品种中含量较高，与超高效液相色谱定量结果一致。4个二聚儿茶素类化合物（表儿茶素-4-8-表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-4-8-表没食子儿茶素、原花青素B1、原花青素B2）在‘永春佛手’乌龙茶中的含量高于‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶。

从上述3种香型乌龙茶的代谢组学差异化合物比较中可以发现，EPSF是清香型‘水仙’乌龙茶中相对于其他两种清香型乌龙茶含量较高的化合物，脂类在浓香型乌龙茶中差异较大，二聚儿茶素类在浓香型和陈香型乌龙茶中均在‘永春佛手’品种中含量较高，黄酮（醇）糖苷、生物碱类化合物在3种香型中均具有较大差异，且黄酮（醇）糖苷是3种香型中差异种类和数量最多的化合物，绝大部分均以‘永春佛手’品种含量最高，表明黄酮（醇）糖苷可能是3种香型乌龙茶中‘永春佛手’与对照品种（‘铁观音’‘水仙’）间的关键差异化合物。

2.3 黄酮（醇）糖苷定量分析

为了进一步验证黄酮（醇）糖苷在3个品种中的差异，对上述3个品种制成的清香型、浓香型和陈香型乌龙茶进行黄酮（醇）糖苷定量分析（表3）。黄酮总量为使用三氯化铝法测定茶叶中黄酮（醇）含量，由于茶叶中的黄酮（醇）主要以糖苷形式存在，所以总黄酮含量可以一定程度代表茶叶中的总黄酮（醇）糖苷含量。从表4可以看出，比色法检测得到的总黄酮含量和14个黄酮（醇）糖苷组分，在3种香型的‘永春佛手’乌龙茶中均显著高于同一香型的‘铁观音’和‘水仙’乌龙茶。在3种香型乌龙茶中，由比色法检测到的‘永春佛手’乌龙茶总黄酮含量比相同香型的对照样品高约10 mg·g-1。

由3个品种制成的乌龙茶中，槲皮素糖苷的含量均高于芹菜素糖苷、杨梅素糖苷和山柰酚糖苷。3个品种所制乌龙茶的槲皮素、山柰酚和杨梅素单糖苷中，半乳糖苷含量高于葡萄糖苷；而在槲皮素和山柰酚三糖苷中，葡萄糖酰芸香糖苷的含量高于半乳糖酰芸香糖苷。异牡荆素在3个品种乌龙茶中的含量均高于牡荆素，同时也是芹菜素糖苷中含量最高的组分。芹菜素糖苷的含量在不同品种的乌龙茶中呈现相同的分布：异牡荆素>芹菜素6, 8-C-二葡萄糖苷>芹菜素6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷≈芹菜素6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷>牡荆素。

3 讨论

3.1 主要化学成分对不同品种乌龙茶品质的影响

茶叶中的化学成分是茶汤的物质基础，经沸水冲泡溶解进入茶汤中，影响茶叶的滋味。经感官审评，3个品种的清香型乌龙茶中，‘永春佛手’茶尚醇厚回甘，‘铁观音’具有青味，水仙滋味浓厚。浓香型乌龙茶中，‘永春佛手’和‘铁观音’滋味较醇厚，‘水仙’是醇厚回甘。陈香型‘永春佛手’茶则是口感略厚，较苦，‘铁观音’和‘水仙’均是较薄，有微微的酸味。同一香型中均是‘水仙’品种的汤色最深，滋味强度最高。氨基酸是茶叶鲜味的主要来源，本研究中，‘永春佛手’乌龙茶同一香型的不同样本间茶氨酸含量和氨基酸总量差异较大，平均值与对照品种无显著差异，在审评中不同品种间的鲜爽度无明显的差异。儿茶素类化合物是茶汤中苦涩味的主要来源[30]，本研究的3个品种乌龙茶中，陈香型乌龙茶的‘永春佛手’样品与对照品种乌龙茶的儿茶素组分差异最大，儿茶素总量以及6个主要儿茶素组分（EGC、C、EGCG、EC、ECG、CG）均为‘永春佛手’乌龙茶中含量最高，这导致陈香型‘永春佛手’具有比陈香型‘水仙’和‘铁观音’更强的苦涩味。3个品种制成的浓香型和陈香型乌龙茶的儿茶素总量均不同程度地低于相应的清香型乌龙茶，儿茶素组分可能在浓香型乌龙茶的“焙火”和陈香型乌龙茶的“贮藏”过程中转化为其他物质，并使浓香型和陈香型乌龙茶呈现出相对于清香型更加醇和的滋味特征。咖啡碱作为茶叶中重要的滋味贡献物质，主要呈现苦味，同时与其他多种物质具有互作关系，包括与EGCG混合呈现消隐作用，增强茶氨酸鲜味等[31]，绝对定量结果显示其仅在陈香型乌龙茶中具有统计学差异，且同一品种的不同香型乌龙茶间无明显增减变化，说明咖啡碱具有较高稳定性，并在茶汤的滋味贡献中起到调节作用。没食子酸在‘水仙’品种制成的3种香型乌龙茶中均呈现最高含量，没食子酸主要与茶叶中其他物质协调作用，中和苦味与涩味，使茶汤滋味爽快、圆润，有研究表明没食子酸能够在一定程度上增加绿茶的鲜味[32]。

表3 3种香型乌龙茶中总黄酮及其黄酮（醇）糖苷组分定量

*代表该物质采用标准品验证，quercetin 3-O-galactosylrutinoside和quercetin 3-O-glucosylrutinoside使用quercetin 3-O-rutinoside的标准曲线计算含量，kaempferol 3-O-galactosylrutinoside和kaempferol 3-O-glucosylrutinoside使用kaempferol 3-O-rutinoside的标准曲线计算含量，kaempferol 3-O-glucoside使用kaempferol 3-O-galactoside的标准曲线计算含量，apigenin 6, 8-C-diglucoside、apigenin 6-C-glucoside-8-C-arabinoside、apigenin 6-C-arabinoside-8-C-glucoside使用isovitexin的标准曲线计算含量，myricetin 3-O-galactosylrutinoside、myricetin 3-O-glucosylrutinoside、myricetin 3-O-rutinoside、myricetin 3-O-glucoside使用myricetin 3-O-galactoside的标准曲线计算含量；数据代表平均值±标准差（清香和浓香佛手：n=18；其他n=3,）；a，b，c：不同字母表示‘永春佛手’与相同香型的对照品种（‘铁观音’和‘水仙’）比较具有显著差异（<0.05，Duncan’ test）

* means the compound was verified by standard，quercetin 3-O-galactosylrutinoside and quercetin 3-O-glucosylrutinoside use the standard curve of quercetin 3-O-rutinoside to calculate the content, kaempferol 3-O-galactosylrutinoside and kaempferol 3-O-glucosylrutinoside use the standard curve of kaempferol 3-O-rutinoside to calculate the content, kaempferol 3-O-glucoside uses the standard curve of kaempferol 3-O-galactoside to calculate the content, the standard curve of isovitexin is used to calculate the content of apigenin 6, 8-C-diglucoside, apigenin 6-C-glucoside-8-C-arabinoside and apigenin 6-C-arabinoside-8-C-glucoside, the standard curve of myricetin 3-O-galactoside is used to calculate the content of myricetin 3-O-galactosylrutinoside, myricetin 3-O-glucosylrutinoside, myricetin 3-O-rutinoside and myricetin 3-O-glucoside; The data are mean value ± SD (fresh-scent and strong-scent YCFS: n=18; others: n=3); a , b, c: different letters indicate that there is significant difference between YCFS and the control cultivars (TGY and SX) with the same scent type (＜0.05, Duncan’ test)

EPSF类成分是儿茶素类成分的8-C位或6-C位被N-乙基-2-吡咯烷酮取代形成的一类化合物，近年来相继在不同种类的茶叶中被发现，特别是在年份茶中具有较高含量，且具有良好生物活性而成为研究热门[20,26-29]。本研究中3个品种的不同香型乌龙茶均鉴定了7种EPSF成分。在清香型‘水仙’乌龙茶中7种EPSF的含量均比清香型‘永春佛手’和清香型‘铁观音’乌龙茶的含量高，在浓香型和陈香型中具有差异的种类减少，但仍然为水仙品种制成的乌龙茶中含量较高，包括浓香型的8-C S-EGCG-cThea，陈香型的8-C R-EC-cThea和8-C S-EGCG-cThea，表明‘水仙’品种的鲜叶在加工过程中可能更容易形成EPSF类成分，导致其含量较高。研究表明高温烘焙[28]和贮藏[29]会促进儿茶素类成分与茶氨酸发生反应形成EPSF类成分，在浓香型和陈香型乌龙茶中EPSF类成分差异减少，可能原因是EPSF类成分在浓香型乌龙茶的高温烘焙和陈香型乌龙茶的贮藏过程中含量逐渐增加，导致不同品种间差异减少。乌龙茶中本身具有较多种类和较高含量的二聚儿茶素，但目前其具体的形成途径和变化规律还未有详细报道[33]。在清香型乌龙茶中，具有差异的二聚儿茶素只有1个（EC-(4alpha->8) -ECG），经过高温烘焙的浓香型和贮藏后的陈香型乌龙茶分别有6个（原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1、表儿茶素-4-8-表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-4-8-表没食子儿茶素没食子酸酯）和4个（表儿茶素-4-8-表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素-4-8-表没食子儿茶素、原花青素B1、原花青素B2），除了陈香型乌龙茶中的表儿茶素-4-8-表没食子儿茶素在‘铁观音’和‘水仙’中含量较高外，其他二聚儿茶素均在‘永春佛手’中的含量较高。以上结果表明不同烘焙温度条件下的儿茶素组分形成了不同的二聚儿茶素类成分，同时在积累的含量上可能具有品种差异性，对不同品种乌龙茶中二聚儿茶素类成分的形成差异有待进一步深入研究。

3.2 高黄酮（醇）糖苷是‘永春佛手’品种的重要化学特征

从代谢组学与黄酮（醇）糖苷定量分析结果可以发现，黄酮（醇）糖苷在‘永春佛手’和对照品种中的含量具有较大差异。进行绝对定量的20个黄酮（醇）糖苷中有14个组分在‘永春佛手’品种制成的清香型、浓香型和陈香型乌龙茶中含量最高，同时其总黄酮（醇）含量显著高于对照，这与郭雅玲等[1]发现‘永春佛手’中黄酮含量显著高于其他品种的结果一致。ZHENG等[34]研究发现‘九龙袍’‘浙农902’‘金萱’和‘黄金桂’品种制成的相同茶类中黄酮醇苷总量和组分的差异大于儿茶素总量和组分的差异，说明黄酮（醇）糖苷在其他品种茶树中同样具有较大差异，其可作为区分不同茶树品种所制干茶的关键成分。吴春燕[35]使用LC-MS检测了18个茶树品种鲜叶中14种黄酮（醇）糖苷含量，其中槲皮素糖苷含量均最高，与本研究结果一致。黄酮（醇）糖苷是茶汤的重要呈味物质，具有较低的滋味阈值，对茶汤的涩味具有重要贡献[36]，但在上述审评结果中，‘永春佛手’茶涩味并不突出，可能是由于其他滋味物质协同作用下涩味降低。黄酮（醇）糖苷具有广泛的生物活性，如文献报道山柰酚能够保护胰腺细胞的生存从而起到抗糖尿病的作用[37]，山柰酚和槲皮素可以有效诱导口腔癌细胞的凋亡起到抗癌作用[38]，以及具有抗炎[39]、调节人体代谢[40]等功效。因此，有望将‘永春佛手’品种作为黄酮（醇）糖苷特异性积累的茶树种质资源，对其中高含量的黄酮（醇）糖苷组分进行深度开发，应用于食品保健领域。

4 结论

相比于对照品种‘铁观音’和‘水仙’，‘永春佛手’品种制作的陈香型乌龙茶中茶氨酸含量、氨基酸总量、儿茶素总量均显著高于对照品种，‘永春佛手’品种制作的清香型和浓香型乌龙茶也具有较高的茶氨酸和氨基酸总量，但无统计学差异。采用色谱-质谱联用技术对以上样品进行代谢组学分析，发现清香型、浓香型、陈香型‘永春佛手’乌龙茶与相同香型的对照品种乌龙茶间分别有50种、59种、47种差异化合物，主要为生物碱、氨基酸、香气前体、EPSF、黄烷醇、黄酮（醇）糖苷、脂类等化合物；化合物绝对定量结果显示14个黄酮（醇）糖苷组分在‘永春佛手’茶中含量最高。具有较高含量的黄酮（醇）糖苷类化合物是‘永春佛手’乌龙茶最为显著的特征。

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Study on the Chemical Constituents of Yongchun Foshou Oolong Tea Based on Metabolomics

1Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008;2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;3Yongchun Agricultural and Rural Bureau, Quanzhou 362600, Fujian;4Agilent Technologies (China) Co., Ltd., Beijing 100102

【】 Oolong teas made with different tea cultivars have a great difference in flavor and chemical components. In this study, non-targeted metabolomics, absolute quantitative analysis, and multivariate statistics analysis were used to investigate the chemical differences among Yongchun Foshou (YCFS), Tieguanyin (TGY) and Shuixian (SX) oolong tea and to screen characteristic chemical components of YCFS oolong tea, as well as to study the influence of tea cultivars on chemical components and sensory quality of oolong tea. 【】cv. Foshou was used as the main research sample andcv. Tieguanyin andcv. Shuixian were used as the controls. Three tea cultivars were manufactured into fresh-scent, strong-scent and aged-scent oolong teas. Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF/MS) was used for non-targeted metabolomics analysis to screen differential compounds in the oolong teas made from different cultivars. In addition, ultra-high performance liquid chromatograph, amino acid analyzer and ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap-mass spectrometry (UHPLC-Q-Orbitrap-MS) was applied for absolute quantifications of main chemical constituents and differential compounds in oolong teas made from different tea cultivars. 【】 Compared with the control oolong teas of same scent type, YCFS oolong tea had relatively higher contents in total amino acid and theanine. The contents of total catechins and caffeine were not significantly different among the 3 cultivars in fresh-scent and strong-scent oolong teas, which were the highest in YCFS in aged-scent oolong teas. The content of gallic acid was SX>YCFS>TGY in 3 scent types oolong teas. Metabolomics analysis combined with multivariate statistics analysis showed that the compound patterns in oolong teas made from different tea cultivars were significantly different. In fresh-scent, strong-scent and aged-scent oolong teas, there were 50, 59 and 47 differential compounds between YCFS and control cultivar, respectively. Among them, 23 differential compounds were common, including 14 flavone (flavonol) glycosides, 5 catechins and their derivatives, 1 lipid, 1 alkaloid, 1 organic acid and 1 amino acid. Further quantitative analysis of 20 main flavone (flavonol) glycosides showed that the contents of 14 flavone (flavonol) glycosides were the highest in YCFS oolong teas, whose contents were 1.4 to 14.6-fold of that in TGY oolong teas and were 1.3 to 18.0-fold of that in SX oolong teas. Among four kinds of flavone (flavonol) glycosides, quercetin glycosides were the main flavone (flavonol) glycosides with higher contents than glycosides of kaempferol, myricetin and apigenin. Sensory evaluation combined with chemical composition results showed that the higher contents of flavone (flavonol) glycosides did not significantly enhance the astringency of YCFS oolong tea infusions. 【】 The metabolomics method effectively characterized the component differences in oolong teas made from different tea cultivars in this study. There were obvious differences in compound patterns among YCFS, TGY and SX oolong teas. Flavone (flavonol) glycosides were the most significantly differential compounds. The higher content of flavone (flavonol) glycosides was a major chemical feature of YCFS oolong tea and was expected to be used as a discriminant index for the identification of oolong tea cultivar in the future.

oolong tea; cultivar-characteristic components; metabolomics; LC-MS; flavone (flavonol) glycoside

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.04.012

2021-04-07；

2021-07-01

国家自然科学基金（31972467）、国家现代农业产业技术体系资助（CARS-19）

彭佳堃，E-mail：pengjiakun@tricaas.com。通信作者林智，E-mail：linzhi@caas.cn。通信作者戴伟东，E-mail：daiweidong@tricaas.com

（责任编辑 赵伶俐）