木薯锌指转录因子MeDi19-1基因克隆及表达分析

戴晶 颜彦 杨海 胡伟

摘要：【目的】克隆木薯鋅指转录因子基因MeDi19-1，分析其编码蛋白特征、亚细胞定位、转录激活活性及在木薯不同组织中的表达水平，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。【方法】从木薯KU50扩增MeDi19-1基因编码区（CDS）序列，利用生物信息学软件对其进行预测分析，并构建pNC-Green-SubC-MeDi19-1融合表达载体，通过农杆菌介导转染烟草表皮细胞，观察荧光信号以确定蛋白的亚细胞定位情况。利用酵母系统确定其转录激活活性，并基于木薯不同组织转录组数据分析其组织表达特性。【结果】MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）长度为618 bp，共编码205个氨基酸残基，蛋白分子量为22416.79 Da，理论等电点（pI）为6.10，属于不稳定疏水蛋白，含有Di19蛋白家族典型的锌指结构域zf-Di19。MeDi19-1蛋白的二级结构中含有无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）。MeDi19-1蛋白氨基酸序列与橡胶树（Hevea brasiliensis）Di19蛋白氨基酸序列（XP_021655585.1）相似性最高，为83.50%。MeDi19-1基因启动子元件含有脱落酸（ABA）、赤霉素和茉莉酸等激素响应元件及胁迫响应元件和光响应元件。MeDi19-1蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中，具有转录激活活性，且活性区域在C端。MeDi19-1基因在叶、叶中脉和储藏根中相对表达量较高。【结论】MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员，具有组织表达特异性，主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用，其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。

关键词： 木薯;锌指转录因子;基因克隆;转录激活;表达分析

中图分类号： S533.035.3                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）01-0115-10

Cloning and expression analysis of zinc-finger transcription factor MeDi19-1 gene in cassava

DAI Jing1，2， YAN Yan1， YANG Hai2*， HU Wei1*

（1Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou  571101， China; 2College of Life Science and Technology， Huazhong University of Science and Technology，

Wuhan  430074， China）

Abstract：【Objective】 In this study，a zinc finger transcription factor MeDi19-1 was cloned from cassava. Its coding protein characteristics，subcellular localization，transcriptional activation activity and expression levels in different tissues of cassava were analyzed. This research laid a foundation for further exploration of the function and mechanism of MeDi19-1 in cassava. 【Method】The coding region sequence （CDS） of MeDi19-1 gene was amplified from cDNA of cassava KU50.The bioinformatics analysis predicted the physicochemical properties.The pNC-Green-SubC-MeDi19-1 fusion expression vector was also constructed. By Agrobacterium-mediated transfection of tobacco epidermal cells， and the fluorescence signal was observed to determine the protein subcellular localization.The yeast system was used to determine its transcriptional activation activity， and its tissue expression properties were analyzed based on transcriptomic data from different tissues in cassava. 【Result】The CDS of MeDi19-1 gene（OL620080） was 618 bp in length and encoded 205 amino acids with molecular weight of 22416.79 Da and theoretical isoelectric point （pI） of 6.10. MeDi19-1 protein belonged to an unstable hydrophobin and contained the zinc finger domainzf-Di19 which was typical in Di19 protein family. The se-condary structure of the MeDi19-1 protein contained irregularly coils（53.66%），α-helix（40.49%）， extended chain （4.39%） and β-turn（1.46%）. The amino acid sequence of MeDi19-1 protein had the highest  similarity（83.50%） to the amino acid sequence of Hevea brasiliensis Di19-6 protein（XP_021655585.1）. The promoter of MeDi19-1 contained the cis-acting element involved in the response to abscisic acid （ABA），gibberellin，jasmonic acid，stress  response element and light response element. MeDi19-1 protein was located in nucleus and cytomembrane. MeDi19-1 protein had transcriptional activation activity，and its active region was at the C-terminus. MeDi19-1 showed high expression levels in leaf，mid-veins and storage root. 【Conclusion】The MeDi19-1 gene is a member of the Di19 gene family， has tissue expression specificity and may play a regulatory role in leaves， mid-veins and storage roots， and its encoded protein is involved in the regulation of multiple physiological activities as transcription factors in cassava tissues.

Key words： cassava; zinc-finger transcription factor; gene cloning; transcriptional activation; expression analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（31771859）;Research Project of Sanya Yazhou Bay Science and Technology City （SKJC-2020-2-002）

0 引言

【研究意义】木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科块根作物，是全球热带地区一种重要的粮食作物，具有高产、高淀粉、耐旱、耐贫瘠等特征，目前在饲料、食品及工业领域均具有良好的产业发展潜力（Cock，1982;张鹏，2015;颜彦等，2019）。Di19（Drought-induced 19）蛋白属于Cys2/His2锌指蛋白家族中的一个亚类，广泛存在于真核生物中（Kang et al.，2005），通过参与蛋白间的互作或结合顺式作用元件调控下游基因，进而在植物生长发育和干旱、高盐、低温等逆境胁迫应答中发挥重要的调控作用（Li et al.，2010;Qin et al.，2016;张古文等，2020）。因此，克隆木薯Di19基因并分析其表达模式，对揭示其在木薯应答非生物逆境胁迫中的功能和作用机制具有重要意义。【前人研究进展】锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）是真核细胞中最丰富的蛋白之一，含有由2个半胱氨酸和2个组氨酸包裹一个锌原子形成的手指型典型结构，能结合DNA或RNA（Takatsuji，1999;Laity et al.，2001）。Di19是一类小分子锌指蛋白，包含2个C2H2型结构域和DPLLSF位点、FVQDLVL位点（Liu et al.，2013）。目前已在拟南芥（Gosti et al.，1995）、棉花（Li et al.，2010）、水稻（Wang et al.，2014）、大豆（Feng et al.，2015）、玉米（Zhang et al.，2019）、毛竹（Wu et al.，2020）等多个物种中鉴定出Di19基因。研究发现，拟南芥Di19家族基因在各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，如AtDi19-3基因在莲座叶中相对表达量最高，在茎中最低，而AtDi19-4基因则相反（Milla et al.，2006）。拟南芥Di19家族基因在不同胁迫下的表达模式也不同，如AtDi19-1和AtDi19-3基因的转录水平在干旱胁迫处理后上调，AtDi19-2和AtDi19-4基因被高盐胁迫诱导（Milla et al.，2006），AtDi19-7基因主要受光信号的调控（Kang et al.，2005），表明拟南芥Di19家族基因的生物学功能有所不同。此外，拟南芥Di19基因的T-DNA插入突变体对干旱胁迫高度敏感，而过表达株系的耐旱性显著提高，通过生化分析，进一步证实Di19作为转录因子激活下游基因PR1、PR2和PR5表达，从而提高植物耐旱能力（Liu et al.，2013）。棉花GhDi19-1和GhDi19-2基因在子叶中表达量较高，而在幼苗的下胚层中表达量较低，成熟后则在长角果的顶部和花药中表达量较高，且受干旱和高盐诱导表达（Li et al.，2010）。水稻OsDi19-4通过增强活性氧清除系统能力提高植株的耐旱能力（Wang et al.，2014）。大豆GmDi19-5基因在幼苗中表达量最高的组织是子叶，特别是子叶维管束，同时对高盐、干旱、氧化胁迫和脱落酸（ABA）信号敏感（Feng et al.，2015）。玉米ZmDi19-5基因在不同组织中均有表达，但在茎中表达量最高（张敏，2017）。【本研究切入点】Di19家族基因广泛参与植物生长发育和逆境应答，但至今尚无木薯Di19基因克隆及表达分析的研究报道。【擬解决的关键问题】基于木薯基因组和转录组数据，克隆MeDi19-1基因，并分析其亚细胞定位、转录激活活性及在不同组织中的表达模式，为探究MeDi19-1基因在木薯中的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

木薯KU50由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存提供。植物总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA纯化（回收）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）、反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司。酵母感受态细胞AH109 Chemically Competent Cell和农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。酵母培养SD培养基购自酷来搏（北京）科技有限公司。亚细胞定位载体、酵母双杂交载体和配套连接酶Nimble cloning试剂盒购自壹田生物科技（海南）有限公司。主要仪器设备：CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）、PCR仪（Analytikjena，德国）、超微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）、EPS300电泳仪（Tanon，上海）、4100凝胶成像仪（Tanon，上海）和FluoView FV1000激光共聚焦显微镜（Olympus，日本）。

1. 2 样品采集

选取发育状况良好的木薯品种KU50植株，采集其若干叶片，经液氮处理后于-80 ℃保存备用。

1. 3 RNA提取及cDNA第一链合成

按照植物总RNA提取试剂盒说明提取木薯叶片的总RNA，并采用1.2%琼脂糖凝胶电泳（0.5×TBE电泳缓冲液;150 V，15 min）检测其完整性。采用超微量紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，并于 -80 ℃保存。取完整、纯度合格的RNA样品，按照反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）说明反转录合成cDNA第一链，用ddH2O稀释10倍于-20 ℃保存，用于后续试验。

1. 4 基因克隆及载体构建

在Phytozome网站（https：//phytozome.jgi.doe.gov）上查找MeDi19-1基因（cassava4.1_016324m）的编码区（CDS）序列，设计其引物MeDi19-1F/MeDi19-1R和MeDi19-1F’/MeDi19-1R’（表1），其中，引物MeDi19-1F/MeDi19-1R用于扩增MeDi19-1基因CDS序列;引物MeDi19-1F/MeDi19-1R’用于扩增包含有zf-Di19结构域的N端序列（MeDi19-1N）;引物MeDi19-1F’/MeDi19-1R用于扩增包含有Di19_C结构域的C端序列（MeDi19-1C）。以木薯KU50叶片cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系25.0 μL：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）2.5 μL，cDNA模板1.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，ddH2O补充至25.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA纯化（回收）试剂盒纯化回收目的片段。然后使用Nimble Cloning试剂盒将MeDi19-1与载体pNC-Green-SubC连接，将MeDi19-1、MeDi19-1C和MeDi19-1N分别与pGBKT7连接。以上连接产物分别转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含0.1 mol/L卡那霉素的LB培养基上，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌斑，经菌液PCR鉴定后将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，提取重组质粒于-20 ℃保存备用。

1. 5 生物信息学分析

利用ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析MeDi19-1基因编码蛋白的理化性质，利用NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）CDD进行保守结构域预测分析。利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白的二、三级结构。通过NCBI数据库的BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）对MeDi19-1基因进行开放阅读框预测及同源序列查找。利用DNAMAN 7.0进行CDS序列翻译及同源比对分析，并构建系统发育进化树。利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析MeDi19-1基因的启动子顺式作用元件。

1. 6 亚细胞定位

将重组质粒pNC-Green-SubC-MeDi19-1转化农杆菌GV3101（psoup-p19）感受态细胞中。使用农杆菌介导的瞬时转化法将重组质粒和空载质粒分别在健康的烟草叶片中表达，24 ℃培养3 d后取侵染的叶片，用DAPI染剂染色30 min，激光共聚焦显微镜观察荧光信号。

1. 7 转录激活活性分析

按照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System说明将重组质粒pGBKT7-MeDi19-1、pGBKT7-MeDi19-1N和pGBKT7-MeDi19-1C分别与pGADT7空载体共转入酵母感受态细胞AH109中，分别涂布到二缺（SD/-Leu/-Trp）培养基和四缺（SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His）培养基上，28 ℃培养72～96 h后观察酵母生长状态，检测转录激活活性。

1. 8 組织表达分析

利用Cassava Atlas数据库（http：//shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）中木薯组织中的转录组数据分析MeDi19-1基因（Manes.14G060400=cassava4.1_016324m）在木薯11种组织中的表达水平（Wilson et al.，2017）。

2 结果与分析

2. 1 MeDi19-1基因PCR扩增结果

利用木薯KU50叶片cDNA为模板，以MeDi19-1F和MeDi19-1R为引物进行PCR扩增，获得大小约为600 bp的特异条带（图1）。经回收纯化连接至pGBKT7载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中并挑取阳性克隆进行Sanger测序，将测序结果与MeDi19-1基因CDS标准序列（XP_021592171.1）进行比对，结果显示两者的核苷酸序列相似性达99.52%，在77～79位缺失3个核苷酸，表明克隆获得的序列为MeDi19-1基因CDS序列（OL620080）为618 bp，编码205个氨基酸残基。

2. 2 MeDi19-1蛋白的理化性质及结构域预测结果

MeDi19-1蛋白由205个氨基酸组成，化学式为C969H1500N288O311S8，原子总数为3076，分子量为22416.79 Da，理论等电点（pI）为6.10。MeDi19-1蛋白的不稳定系数为44.97，脂肪族氨基酸指数为71.9，亲水性指数的平均值（GRAVY）-0.401，为不稳定疏水性蛋白。保守结构域预测结果显示，MeDi19-1蛋白含有zf-Di19结构域，证明该蛋白属于Di19家族（图2）。MeDi19-1蛋白的二级结构包含无规则卷曲（53.66%）、α-螺旋（40.49%）、延伸链（4.39%）和β-转角（1.46%）（图3）。MeDi19蛋白的三级结构预测结果与二级结构预测结果一致（图4）。

2. 3 MeDi19-1蛋白的氨基酸序列比对及系统进化分析结果

使用NCBI数据库的Smart BLAST检索MeDi19-1蛋白的同源氨基酸序列，结果显示氨基酸相似性在60%以上的物种包括橡胶树（Hevea brasiliensis）83.50%、麻疯树（Jatropha curcas）77.78%、蓖麻（Ri-cinus communis）75.36%、银白杨（Populus alba）68.75%、毛果杨（Populus trichocarpa）68.27%、美洲黑杨（Po-pulus deltoides）67.31%、可可树（Theobroma cacao）60.85%、哥伦比亚锦葵（Herrania umbratica）60.65%、土瓶草（Cephalotus follicularis）60.38%和雷公藤（Tripterygium wilfordii）60.09%。对这些同源氨基酸序列进行多序列比对，结果（图5）显示，MeDi19-1氨基酸序列与标准序列（XP_021592171.1）相比，在24位缺失一个丝氨酸，在25位丙氨酸突变为丝氨酸，在其N端的42～95位氨基酸上均存在保守的zf-Di19结构域。根据氨基酸序列的相似性构建系统发育进化树，结果（图6）显示，MeDi19-1蛋白与橡胶树（Hevea brasiliensis）、麻疯树（Jatropha curcas）和蓖麻（Ricinus communis）Di19蛋白的亲缘关系最近。

2. 4 MeDi19-1基因启动子元件分析结果

利用PlantCARE分析MeDi19-1基因上游2000 bp的启动子序列，结果（图7）发现，该基因启动子除包含基本元件TATA-box和CAAT-box外，还包含光响应元件（I-box和Box 4）、胁迫响应元件（TC-rich repeats）、脱落酸（ABA）应答元件（ABRE）、赤霉素响应元件（TATC-box）、茉莉酸响应元件（TGACG-motif）和厌氧感应元件（ARE），推测MeDi19-1基因的表达受到ABA、赤霉素、茉莉酸、光信号和逆境脅迫等多种信号的调节。

2. 5 MeDi19-1蛋白亚细胞定位分析

将携带有GFP荧光蛋白基因的质粒pNC-Green-SubC与MeDi19-1基因CDS序列连接，成功构建植物表达载体pNC-Green-SubC-MeDi19-1。采用农杆菌介导瞬时转化系统将植物表达载体在烟草叶片中表达，使用荧光共聚焦显微镜观察侵染后叶片的荧光信号，结果显示烟草叶片细胞的细胞核和细胞膜中有荧光信号（图8），表明MeDi19-1蛋白可能定位于木薯的细胞核和细胞膜中。

2. 6 MeDi19-1蛋白转录激活活性鉴定结果

为探究MeDi19-1蛋白的转录激活活性及活性区域，将MeDi19-1蛋白按照结构域分别拆分为N端366 bp区段（MeDi19-1N）和C端255 bp区段（MeDi19-1C）。将MeDi19-1、MeDi19-1C和MeDi19-1N与pGBKT7载体连接，成功构建pGBKT7-MeDi19-1、pGBKT7-MeDi19-1N和pGBKT7-MeDi19-1C酵母表达载体。将构建的酵母表达载体分别与pGADT7空载体在酵母中共表达，观察酵母在SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上生长情况，结果表明含pGBKT7-MeDi19-1和pGBKT7-MeDi19-1C的酵母及阳性对照在2种培养基上生长良好（图9），表明MeDi19-1具有转录激活活性，且其活性区域在C端。

2. 7 MeDi19-1基因组织表达分析结果

利用转录组数据分析MeDi19-1基因在松散性胚性愈伤组织（FEC）、组织化胚性结构（OES）、根尖分生组织（RAM）、纤维根（FR）、储藏根（SR）、茎尖分生组织（SAM）、侧芽（Lateral.Bud）、茎（Stem）、叶柄（Petiole）、中脉（Mid.Vein）和叶（Leaf）共11种木薯组织中的相对表达量，结果如图10所示。MeDi19-1基因在木薯11个组织中均有表达，在叶片、叶中脉和储藏根中的相对表达量较高，在松散型胚性愈伤组织和组织化胚性结构中的相对表达量较低，表明MeDi19-1基因具有组织表达特异性，可能主要在叶片和储藏根中发挥调控作用。

3 讨论

Di19家族基因编码一种小分子锌指蛋白，已在多种植物中被识别，其可能参与植物生长发育（Milla et al.，2006）、光信号应答（Kang et al.，2005）和非生物逆境胁迫应答（Liu et al.，2013），且受生长素、脱落酸等多种激素的调控（Liu et al.，2013）。木薯是热带和亚热带地区重要的经济作物和粮食作物之一，也是全球三大薯类作物之一（张鹏等，2014;赵思涵等，2019），研究木薯Di19基因的序列特征和表达模式可为进一步揭示其功能和作用机制提供理论参考。本研究对MeDi19-1基因进行克隆和生物信息分析，结果表明MeDi19-1蛋白含有Di19蛋白家族特有的zf-Di19结构域，且在MeDi19-1基因启动子上含有响应ABA诱导的核心元件ABRE。拟南芥AtDi19-3基因启动子区域也含有核心元件ARBE，该基因已被证实受ABA信号调控（Qin et al.，2014），故推测MeDi19-1基因受ABA信号的调控。酵母双杂交系统分析结果表明，MeDi19-1蛋白在C端具有转录激活活性，与大豆和拟南芥的Di19蛋白研究结果一致（赵娟莹等，2017），推测MeDi19-1蛋白在木薯中作为转录因子参与调控多项生理活动。而亚细胞定位结果显示，MeDi19-1蛋白定位于细胞核和细胞膜，与拟南芥（Qin et al.，2014）和棉花（Qin et al.，2016）的Di19蛋白仅定位于细胞核的结论不同，其原因可能是由于MeDi19-1与拟南芥和棉花中Di19蛋白的亲缘关系较远，其功能存在一定的差异。由于植物蛋白质的亚细胞定位结果可暗示其功能特性（邢浩然等，2006）。故推测定位于细胞核中的MeDi19-1蛋白可作为转录因子参与下游蛋白的转录调控，亚细胞定位与其功能相符。细胞膜的主要功能是能量转换、物质运输、信息识别与传递等（武春飞等，2009），定位于细胞膜上的MeDi19-1蛋白则可能参与细胞膜相关功能，结合蛋白结构的预测结果推测其参与细胞膜上的信息传递。

此外，对MeDi19-1基因在木薯不同组织中的表达水平进行分析，结果发现MeDi19-1基因在叶片、叶中脉和储藏根中的表达量较高。叶片是植物主要的光合作用器官（Nikolov et al.，2019），通过多种信号通路参与调控叶片的生长发育、衰老和应激反应（Du et al.，2018）;叶脉主要负责水、营养和糖的运输并提供机械支撑（Sack et al.，2013）;木薯储藏根的形成和发育则包含细胞的分裂伸长和营养物质的积累（Sojikul and Scoffoni，2015）。结合MeDi19-1基因的启动子顺式作用元件分析结果，推测MeDi19-1作为转录因子参与木薯叶片发育、光应答、营养运输和储藏根发育。目前拟南芥、水稻等模式植物中Di19蛋白均被证实响应盐胁迫和干旱胁迫（Milla et al.，2006）。木薯作为一种耐贫瘠的作物，生存环境中存在多种非生物逆境胁迫，MeDi19-1蛋白可能参与木薯抗逆的多个生理生化过程，故在后续研究中需进一步深入解析MeDi19-1蛋白在木薯抗逆中的生物学功能，尤其是响应干旱胁迫过程中的功能。

4 结论

MeDi19-1基因属于Di19基因家族成员，具有组织表达特异性，主要在叶、叶中脉和储藏根中发挥调控作用，其编码蛋白在木薯组织中作为转录因子参与调节多项生理活动。

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（責任编辑 陈 燕）