长江中下游区试水稻品种稻瘟病抗性评价及抗性基因检测

陈晴晴 杨雪 张爱芳

摘要：【目的】探究長江中下游区试水稻品种稻瘟病抗性水平及抗性基因聚合对稻瘟病抗性的效应，为新品种的审定及抗病品种的合理利用提供理论依据。【方法】采用人工喷雾接种方法鉴定2018—2020年长江中下游区试252个水稻品种的稻瘟病抗性，并利用2组多重PCR体系（Pi1与Pikh、Pi9与Pik）检测供试水稻品种携带抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的情况，分析抗性基因聚合方式与稻瘟病抗病率的关系。【结果】2018—2020年供试材料的穗瘟抗病率分别为47.0%、38.3%和35.2%，穗瘟抗病率逐年下降。252份供试材料含有抗性基因数为0～4个，其中含0个抗性基因的材料有14份，占5.6%，穗瘟抗病率为14.3%;含1个抗性基因的材料有63份，占25.0%，穗瘟抗病率为11.1%;含2个抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率为42.0%;含3个抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率为65.4%;含4个抗性基因的材料有13份，占5.2%，穗瘟抗病率为53.8%。总体来看，供试材料的穗瘟抗病率随携带的抗性基因数增加呈上升趋势。抗性基因组合Pi9+Pikh、Pi9+Pik+Pikh和Pi9+Pik+Pi1+Pikh是适合安徽地区的抗性基因组合。【结论】2018—2020年长江中下游区试水稻品种稻瘟病抗性一般。多基因聚合能提高水稻品种的稻瘟病抗性，但应选择合适的抗性基因组合，不能简单叠加。

关键词： 水稻;稻瘟病;基因检测;抗性鉴定;长江中下游

中图分类号： S435.111.41                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2022）01-0021-08

Evaluation of rice blast resistance and detection of resistance genes of rice varieties in regional trials in the middle and lower reaches of Yangtze River

CHEN Qing-qing， YANG Xue， ZHANG Ai-fang*

（Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality and Safety， Anhui Academy of

Agricultural Sciences， Hefei  230001， China）

Abstract：【Objective】To explore the blast resistance level of rice varieties tested in the middle and lower reaches of the Yangtze River and the effect of resistance gene aggregation on the resistance of rice blast and provide a theoretical basis for the approval of new varieties and the rational use of disease-resistant varieties. 【Method】The artificial spray inoculation method was used to identify the rice blast resistance of the 252 varieties in regional trials in the middle and lower reaches of the Yangtze River from 2018 to 2020. Two sets of multiplex PCR systems （Pi1 and Pikh， Pi9 and Pik） were used to detect the resistance genes Pi9， Pik， Pi1 and Pikh in the tested rice varieties. The relationship between the aggregation mode of resistance genes and the resistance rate of rice blast was analyzed. 【Result】The spike blast resistance rates of the tested materials from 2018 to 2020 were 47.0%， 38.3% and 35.2%， respectively， which decreased year by year. 252 tested materials contained 0 to 4 tested resistance genes. There were 14 materials containing no tested resistance genes， accounting for 5.6%， and the spike blast resistance rate was 14.3%; 63 materials contained 1 resistance gene， accounting for 25.0%， and the spike blast resistance rate was 11.1%; 81 materials contained 2 resistance genes， accounting for 32.1%， and the spike blast resistance rate was 42.0%; 81 materials contained 3 resistance genes， accounting for 32.1%， and the spike blast resistance rate was 65.4%; 13 materials contained 4 resistance genes， accounting for 5.2%， and the spike blast resistance rate was 53.8%. In general， the spike blast resistance rate of the tested materials increased with the number of resistance genes， showing an upward trend. The rice blast resistance gene combinations Pi9+Pikh， Pi9+Pik+Pikh and Pi9+Pik+Pi1+Pikh were suitable resistance gene combinations in Anhui. 【Conclusion】The resistance to blast disease of rice varieties tested in the middle and lower reaches of the Yangtze River from 2018 to 2020 is average. Multi-gene aggregation can improve rice blast resistance， but the appropriate combination of resistance genes should be selected instead of simply superposition.06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

Key words： rice; rice blast; gene detection; resistance identification; middle and lower reaches of Yangtze River

Foundation items： National Agricultural Financial Funding Project （2018-2020）

0 引言

【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）种植区域分布于除南极洲外的世界大部分地方，全世界有一半的人口以稻米为主要粮食（杨德卫等，2019）。水稻是我国主要粮食作物之一，超过半数的人口以大米为主食，种植面积和产量均居世界前列。长江中下游地区是我国重要的水稻生产区，水稻的稳定、安全生产对保障国家粮食安全具有重要意义（李建等，2020）。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的对水稻危害最大的世界性真菌病害之一（Tan et al.，2021），其广泛发生于我国不同水稻种植区，并且在水稻不同生长时期均可发生，严重影响稻米的产量和品质（刘世江等，2020）。目前，培育和利用抗病品种仍是最经济、有效控制稻瘟病的方法（韩雪琴等，2021）。然而，由于稻瘟病菌经抗病品种选择后会发生变异，含有单一或少数抗稻瘟病基因的推广品种在几年种植后抗性会逐渐丧失（朱业宝等，2020），尤其在气候不利的年份，病害容易暴发，导致严重减产。因此，鉴定长江中下游区试水稻品种的稻瘟病抗性，并分析抗性基因聚合对抗性水平的效应，对筛选和利用新的抗病品种具有重要意义。【前人研究进展】近年来，随着分子生物学的发展，国内外研究者已鉴定了183个水稻稻瘟病抗性相关基因（QTL），并克隆了37个抗性基因（国家水稻数据中心，2012）。随着越来越多的抗稻瘟病基因被克隆，基于抗病基因功能序列开发的分子标记，促使人们能够快速、准确地鉴定各种水稻种质资源抗病基因的分布，进而指导水稻抗病分子育种（陈子强等，2016）。大量研究发现，利用多个抗性基因是培育广谱、持久抗性品种的有效手段。谢倩凤等（2015）在82份水稻种质资源中发现宽抗谱和中等抗谱的材料分别有11份（13.4%）和55份（67.1%），以携带Pia基因的材料最多（78.0%）。潘争艳等（2019）发现抗性基因Pi40、Pi9、Pigm和Pita在辽宁省粳稻品种选育和生产上具有重要的应用潜力。张海珊等（2020）通过抗稻瘟病单基因系水稻品种与稻瘟病菌的互作研究，发现在安徽地区抗稻瘟病基因Pi9和Pik对水稻品种抗病性贡献较大。张银霞等（2020）针对宁夏地区水稻种质资源的研究发现，其主要的抗稻瘟病基因有Pikm、Pi9、Pi2、Pi5和Pid2。王晓玲等（2021）对82份籼粳骨干亲本抗稻瘟病基因进行分子检测，明确了这些材料抗瘟基因的分布，为广谱持久抗性籼粳材料创制骨干亲本的选择与配组指明了方向。在目前已克隆的抗性基因中，Pi9、Pik、Pi1和Pikh具有广谱抗性，其中Pik基因对我国许多稻瘟病菌小种有较强的、稳定的抗性（Zhai et al.，2011）;Pi1基因来自西非水稻品种LAC23，对来自我国8个稻区的稻瘟病菌株表现抗病，对华南稻区的稻瘟病菌株表现显著抗性（李进斌等，2012）;Pikh基因是从越南水稻品种Tetep中鉴定获得，对来自印度的稻瘟病菌株表现高抗（Zhai et al.，2014）;Pi9基因来自野生稻，对来自13个国家或地区的43个稻瘟病菌株具有抗性，对21个稻瘟病菌小种具有抗性，是一个稻瘟病广谱抗性基因（曹妮等，2019）。【本研究切入點】目前，对于稻瘟病抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh在安徽地区的聚合效应尚不清楚，不利于抗性基因在育种中的应用以及抗病品种的合理布局。【拟解决的关键问题】采用人工喷雾接种法对2018—2020年长江中下游区试252个水稻品种进行稻瘟病抗性鉴定，并利用特异引物检测供试品种携带抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的情况，分析品种稻瘟病抗性与抗性基因聚合的关系，为新品种的审定及抗病品种的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

以中国水稻研究所提供的长江中下游区试水稻品种为研究材料，2018—2020年分别有100、81和71份，共计252份。对照品种单18（含Pi9）、特特普（含Pi1和Pikh）、关东51（含Pik）（陆展华等，2020b）和丽江新团黑谷（感病对照品种）均由本课题组提供。供试稻瘟病菌由安徽省优势种群（ZB群）和强致病种群（ZA群）的不同菌株组成，由本课题组分离鉴定并保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 稻瘟病菌接种鉴定 供试菌株在马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）上26 ℃恒温培养;1周后转移至大麦粒培养基，待大麦粒上布满菌丝后，置于26 ℃恒温保湿培养;培养1 d后，将附着稻瘟病菌孢子的大麦粒经无菌水清洗、过滤、离心，收集孢子液，加入0.05%吐温，配制成2×105个孢子/mL的孢子悬浮液（陈晴晴等，2020）。

供试材料经过浸种、催芽后，按顺序分别播种在带孔、装有细土、穴间隔3 cm的塑料盘中，每个品种播10～15粒。浇水盖土，保证正常出苗生长。秧苗移栽，每个品种2行，每行3穴，每穴2～4棵基本苗，株行距14 cm×20 cm，品种按顺序排列。试验品种四周种植感病品种，每20个品种设置感病对照。鉴定圃施肥量较高，治虫不治病。在水稻孕穗期至破口期，用混合菌株孢子悬浮液喷雾接种20个穗子，接种后将水稻捆扎成束，并定时喷雾降温保湿。在水稻黄熟初期（80%稻穗尖端谷粒成熟时）调查穗瘟，调查和评价参照NY/T 2646—2014《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》进行，详见表1。

1. 2. 2 抗性基因的分子检测 用DNAsecure Plant Kit （TIANGEN DP320）提取水稻叶片DNA。用于PCR扩增的引物相关信息见表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

为简化检测过程，分别设置Pi1与Pikh（李忠楠等，2018）、Pi9与Pik双基因的2组多重PCR体系，PCR扩增体系20.0 μL：2×Taq PCR SuperMix（北京金普顿生物科技有限公司）10.0 μL，2组10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，20～100 ng/μL的基因组DNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳分离，4S Red Plus核酸染料染色，凝胶成像系统下拍照。依据分子标记对应的基因片段大小，参照Marker赋值，判断每份材料4个抗性基因的有无。

1. 3 数据分析

为分析抗性基因聚合方式与稻瘟病抗性之间的关系，参考朱业宝等（2020）的方法，将高抗—中抗均统计为抗病，中感—高感均统计为感病。以抗病率分析数据，抗病率（%）=抗病材料数/供试材料数×100。

2 结果与分析

2. 1 长江中下游区试水稻品种的穗瘟抗性鉴定结果

由表3可知，2018—2020年供试材料中均未鉴定出高抗材料;仅2019年鉴定出表现为抗的材料;2018年中抗材料占比高于2019和2020年;2018—2020年表现为中感材料占比逐年升高;2019年感病材料占比低于2018和2020年;2018年未鉴定到高感材料，但2019和2020年均鉴定到高感材料。总体来看，2018—2020年供试材料的穗瘟抗病率逐年下降，抗性水平一般。

对照品种按照穗瘟发病率分级标准评价，单18和特特普的抗感类型为中抗，关东51的抗感类型为感，丽江新团黑谷为高感。

2. 2 抗性基因的分布情况分析

利用4个抗性基因（Pi9、Pik、Pi1和Pikh）的分子标记，并运用Pi1与Pikh、Pi9与Pik的2组多重PCR体系，对252份供试材料进行检测，对照品种和部分供试材料的PCR产物电泳图见图1。检测到163份材料出现800 bp抗病的特征条带;150份材料出现102 bp抗病的特征条带;25份材料出现460 bp抗病的特征条带;182份材料出现216 bp抗病的特征条带，表明Pi9、Pik、Pi1和Pikh的检出率分别为64.7%、59.5%、9.9%和72.2%，另外结合穗瘟抗性表现，其抗病率分别为52.1%、51.3%、44.0%和48.9%。

由图2可知，含抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的供试材料占比在2018—2020年发生变化，2018年分别为65.0%、61.0%、12.0%和69.0%，2019年分别为54.3%、58.0%、2.5%和75.3%，2020年分别为76.1%、59.2%、15.5%和73.2%。可见，长江中下游区试水稻品种中Pi9、Pik和Pikh基因频率高于Pi1。

2. 3 抗性基因数量与抗性水平分析

252份供试材料含有抗性基因数为0～4个，含0个抗性基因的材料有14份，占5.6%，穗瘟抗病率为14.3%;含1个抗性基因的材料有63份，占25.0%，穗瘟抗病率为11.1%;含2个抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率为42.0%;含3个抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率为65.4%;含4个抗性基因的材料有13份，占5.2%，穗瘟抗病率为53.8%。由此可见，当供试材料所含抗性基因数由1个增加到3个时，其材料数、占比和穗瘟抗病率均明显增加;而当抗性基因数增加到4个时，其材料数和占比最少，穗瘟抗病率略低于含3个抗性基因的材料。以抗性基因数与穗瘟抗病率作折线图，供试材料从含有1个抗性基因上升到3个抗性基因时，穗瘟抗病率明显升高（图3）。总体来看，供试材料的穗瘟抗病率随抗性基因数的增加呈上升趋势。

2. 4 抗性基因组合与抗性水平

为进一步分析2个和3个抗性基因组合与抗性水平间的关系，将检测到含有相同基因组合的材料归为1个基因组合，列于表4。结果发现，抗病率较高且占比较高的2个抗性基因组合为Pi9+Pikh;3个抗性基因组合为Pi9+Pik+Pikh。另外，4个抗性基因组合Pi9+Pik+Pi1+Pikh的抗病率为53.8%，也是较好的抗性基因组合。

3 讨论

水稻是世界上主要粮食作物之一，稻瘟病是广泛分布在所有水稻种植区的重要病害之一（Chen et al.，2015;邓云等，2020）。我国几乎所有水稻栽培地区均会发生稻瘟病。由于水稻种植区之间的差异，导致不同区域稻瘟病菌生理小种繁多、优势小种构成不同，且高度变异，不同年份的病原菌优势小种组成常发生动态变化（江川等，2019;刘艳等，2019）。因此，我国在审定水稻品种时需在不同区域开展水稻品种的稻瘟抗性鉴定。针对2018—2020年长江中下游区试水稻品种，在安徽地区进行稻瘟病抗性鉴定，結果发现，2018—2020年供试材料的抗性水平一般，穗瘟抗病率分别为47.0%、38.3%和35.2%，逐年略有下降。

抗稻瘟病基因的发掘与利用是抗病育种的基础和核心（何奕霏等，2021），只有了解品种的抗性基因，才能有针对性地改良及利用品种抗性。何海燕等（2019）研究发现5个抗性基因在浙江省水稻品种中分布频率不同，其中Pib基因分布最广，但仅有15个品种的抗性频率在70%以上，大部分品种携带1～2个抗性基因，聚合多个抗性基因的品种抗性水平相对较高。陆展华等（2020a）对广东省主栽水稻品种的稻瘟病主效抗性基因及自然抗性进行鉴定，发现Pib和Pita的检出率高，但抗性较弱，未检出Pi1和Pi9，而Pi2表现抗性较好。Manojkumar等（2020）对印度卡纳塔卡邦纳姆佩特和曼迪亚地区水稻品种进行稻瘟病抗性评价，发现20个主要抗稻瘟病基因的个体基因频率在10.34%～100.00%，Pi9和Pizt基因分布频率分别较少和较多。这些研究表明不同地区水稻品种中抗性基因分布不同，分布频率较少或较多说明抗性基因在品种中分别少量或大量存在，抗性表现也存在差异。本研究利用抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的分子标记，设置2组多重PCR检测体系，可经济、快速、准确地判断供试水稻材料的抗性基因类型，结果发现，长江中下游区试水稻品种中Pi9、Pik、Pi1和Pikh的基因频率在9.9%～72.2%，抗病率在44.0%～52.1%，说明供试材料中Pi1与Pikh分别少量和大量存在，每个抗性基因表现出的抗性水平差异不大。06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

本研究发现，含有单个抗性基因的供试材料抗性水平不高，随着聚合基因数从1个增加到3个，穗瘟抗病率从11.1%上升到65.4%，供试材料的稻瘟病抗性水平呈上升趋势，与孙立亭等（2019）、宛柏杰等（2020）的研究结果一致;但供试材料含有4个抗性基因，即抗性基因组合为Pi9+Pik+Pi1+Pikh时，穗瘟抗病率略下降到53.8%。进一步研究2个和3个抗性基因组合与抗性水平间的关系，获得抗病率较高且占比较高的2个抗性基因组合为Pi9+Pikh，3个抗性基因组合为Pi9+Pik+Pikh。可见，抗性基因组合Pi9+Pikh、Pi9+Pik+Pikh和Pi9+Pik+Pi1+Pikh是安徽地区较合适的基因组合。此外，本研究中有2份水稻材料未检测到4个待测抗性基因，但抗病性表现较好，推测其可能含有其他抗性基因，值得进一步探究。

4 结论

2018—2020年长江中下游区试水稻品种稻瘟病抗性一般。含有单个抗性基因的水稻品种抗性水平不高，随着聚合基因数增加，稻瘟病抗性水平呈上升趋势。多基因聚合能提高水稻品种的稻瘟病抗性，但抗性强弱取决于抗性基因间的互作效应，并不是简单的累加效应。水稻育种时应选择聚合在品种推广地区抗性较好的基因组合。

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