火棘果中多酚提取工艺优化

罗翠婷　 江富祥　董芬　曹莉

摘要：本研究以火棘果为原料，利用乙醇溶液提取其中的多酚，采用福林酚法测定多酚的含量。在单因素实验的基础上，利用中心组合设计和响应面分析优化多酚的提取工艺。结果表明火棘果中多酚的最佳提取工艺为： 料液比为1：12（g：mL），乙醇浓度为73%，PH为3.6，温度为80℃，提取时间60min，提取次数为2次。依照优化条件的工艺，得到的多酚平均值为13.575 mg/g，与回归方程计算得到的理论值响应值13.756 mg/g基本吻合，该研究为有效地利用我国火棘这一丰富的野生资源提供了理论依据。

关键词：火棘;多酚类物;提取;响应面分析

火棘（Pyracantha fortuneana （Maxim） Li.）为蔷薇科火棘属植物，又名火把果、救命粮、赤阳子等，其分布很广，多分布在亚洲东部至欧洲南部。火棘不仅具有观赏价值，同时它也是重要的天然色素、果胶及饲料资源，而且它的果实的营养丰富，具有食用价值和药用价值。研究表明火棘果具有较强的抗疲劳、降血脂、保护心肌、消食健脾和通便润肠功效，同时可以滋润及美白皮肤。

植物多酚是植物体内的复杂酚类次生代谢物，具有多元酚结构。多酚是火棘果重要的药效成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒的作用。目前对火棘果的研究主要集中在多糖、黄酮及原花青素等方面，而对其中多酚的提取及相关报道相对较少。另外，由于成分化学结构不明确，药效成分的开发研究不够深入，限制了多酚在功能性食品和医药制品领域的广泛应用，进而制约了火棘果中医药产业的发展。本研究利用响应面优化试验对火棘果多酚提取工艺进行探讨，为充分利用火棘果多酚提供依据，这对于火棘果资源的深度开发和综合利用具有极大的促进作用。

1材料与方法

1.1材料与试剂

火棘果：采摘湖北恩施来凤地区。

标准品：没食子酸（特级），上海源叶生物科技有限公司。

其它试剂：无水碳酸钠、浓盐酸、无水乙醇、正丁醇、丙酮、甲醇（以上均为分析纯）、Foline-pheno。

1.2仪器

数字酸度计：杭州东星仪器厂;集热式恒温加热磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限公司;754型紫外可见分光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;电热恒温水浴锅：武汉琴台医疗器械厂;台式离心机：上海安亭科学仪器厂;循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂;电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制

用10ml乙醇溶解0.5g没食子酸标准品，用蒸馏水定容至100mL，然后分别移取0、1、2、3、5、10ml到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容，分别稀释成0、50、100、150、250、500mg/ml的溶液。用移液管分别移取20uL稀释溶液到每个比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno试剂摇匀，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液摇匀，置于40℃恒温水浴锅中30min，显色后于765nm波长下测定其吸收度。以没食子酸标准品质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，即得回归方程A=0.0052C+0.0664，其中R=0.9955，表明质量浓度为0～0.005 mg/mL时线性关系良好。

1.3.2火棘样品中多酚含量测定

用移液管移取2.5ml样品于25mL容量瓶中，精密吸取待测液20uL到比色皿中，依次加入1.58mL水、100uL Foline-pheno试剂摇匀，等30s到8min，加入300uLNaCO 溶液摇匀，置于40℃恒温水浴锅中30min，显色后于765nm波长下测定其吸收度，由标准曲线计算多酚含量。

2结果与分析

2. 1单因素试验

称取火棘果皮肉粉10g，以乙醇为提取溶剂，一定料液比及提取温度，回流提取一定时间后，冷却至室温后，分别过滤后定容至一定体积，用分光光度计在765nm处测定各浸提液的吸光度值。分别依次考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、pH值及提取次数对原花青素提取得率的影响，结果分别见图1～图6。

由图1可知：随着乙醇浓度的提高，多酚化合物的提取率呈上升的趋势，当乙醇浓度达到70%时多酚化合物提取率最高，之后随着浓度的增加，提取率反而降低。这是因为当高于此浓度后醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，多酚溶出量相对减少，故选70%的乙醇为提取条件。

由图2可知：20～80℃时，多酚提取率随温度的升高而增大，在80℃时多酚得率最高。这是由于随着温度升高，多酚的渗透、溶解、扩散速度也加快，使其溶解度增加。但是高温会促进多酚氧化分解，使其提取率下降。因此，火棘中多酚提取温度不宜过高，提取温度80 ℃最合适。

由图3可知：随着时间的增加，多酚的提取率不断升高，在60min达到最大值，随后趋于稳定。因为多酚化合物中某些热稳定性差的成分会分解或在空气中被氧化，导致提取率降低，因此，提取时间为60min最合适。

由图4可知：多酚得率随料液比的增长呈现先增加后平缓的趋势，表明当料液比增大到1：10（g：mL）时原料中的多酚已被充分提取出来，多酚得率达到峰值，因而继续增大料液比，多酚得率不会明显提高。综合考虑成本及后续浓缩处理，料液比选取1：10（g：mL）较为合适。

由图5可知：酸性条件更有利于多酚的提取，其主要是因为酸可破坏蛋白质、多糖、纤维素与多酚的结合，从而提高多酚的提取率和提取速度。但過度酸化，会造成多酚酸解沉淀，多酚提取率反而下降，因此选取pH为3左右较合适。

由图6可知：多次提取能增加多酚的提取量，但两次提取已基本提取完全，再增加提取次数，提取量较少，而且随着提取时间加长却相反的引起多酚物质的分解，降低提取量，其他杂质成分也溶出增多，确定本次实验提取两次。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面优化设计方案

根据Box-Benhnken 中心组合实验设计原理，在单因素试验基础上选取对火棘果多酚影响显著的3个因素：投料比，乙醇浓度，PH值进行进一步优化考察，实验因素与水平设计见表 1。

以X1（投料比）、X2（乙醇浓度）、X3（PH值）为自变量，以火棘果多酚提取率为响应值（Y），响应面试验设计及结果见表2。

2.2.2模型的建立及显著性检查

利用design-expert7.1.6统计软件对上表数据进行多元回归拟合，经回归拟合后，试验因素对响应值的影响可用回归方程表示为：

Y=-608.72039+4.92928X1+19.23890X2+8.16980X3+0.10904X1X2-0.34447X1X3+0.068925X2X3-0.49230 X1-0.14228 X2-1.26057 X3

从表回归方程模型系数的显著性检验可知模型一次项X1、X2、X3，二次项X1、X2、X3，交互项X1X3、X1X2对响应极显著影响，X2X3对响应值显著影响，表明料液比、乙醇浓度、PH值对多酚提取的主效应明显，且在料液比、乙醇浓度和PH之间都存在交互作用。此外，F（X1）>F（X2）>F（X3）表明所选的3个因素中，投料比对多酚提取率影响最大，乙醇浓度次之，PH值相对最小。从该方程的方差分析可知本试验所选模型不同处理间差异极显著 P<0.0001，失拟项Lack of Fit =0.6584>0.05，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时其应变量与全体自变量之间的线性关系是显著的即这种试验方法是可靠的，拟合情况好，可用此模型对火棘果多酚的提取进行分析和预测。

2.2.3响应面分析及最优条件的确定

采用design-expert7.1.6统计软件绘制响应面图及等高线，结果见图10和图11。由图10可知，料液比和乙醇浓度对火棘果中多酚提取率的影响最为显著，在料液比为7.5～12.5（g：mL），乙醇浓度为65%～75%交互作用下所得的多酚得率最高。

通过响应面分析，可得三个因子的最优实验点代码值为（0.33149，0.262916，0.292138），变换为真实值即为：料液比为11.65745（g：mL），乙醇浓度为72.62916%，PH值为3.584276，在此条件下提取的多酚是最好的，理论值可达13.756 mg/g。

2.2.4回归模型的验证实验

按照优化的提取条件进行验证实验，重复3次，结果得多酚的平均含量为13.575mg/g，实验值与模型的理论值13.756mg/g非常接近，说明优化提取条件重现性良好，此响应面优化回归模型是合理可靠的，对实际工艺操作具有一定的指导意义。

3.结论

本研究建立了一个以火棘果多酚提取量为考察指标，以投料比、乙醇浓度、PH值、提取温度、提取时间、提取次数为评价因素，通过中心组合设计和响应面分析，建立響应面模型。利用 Design-Expert 7.1.6软件对回归方程进行优化计算，确定了火棘果中多酚的最佳提取工艺条件：料液比为1：12（g：mL），乙醇浓度为73%，PH=3.6，温度为80℃，提取时间60min，提取次数为2次。在此工艺条件下，多酚提取值为13.575 mg/g，与理论值响应值13.756mg/g基本吻合，进一步说明了响应面法优化提取火棘多酚是可行的，适合于提取火棘果中多酚工业化生产。

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作者介绍： 罗翠婷， 女，硕士研究生， 从事天然药物化学、药学教学研究.