支链氨基酸代谢在糖肽类和环脂肽类抗生素产量提高与组分优化中的应用

李辉 方志锴 郭霞凌 江红,*

(1 大邦(湖南)生物制药有限公司，长沙 410221；2 福建省微生物研究所，福州 350007)

自青霉素1941年应用于临床以来，人类已发现了上万种抗生素，其中临床上常用的抗生素有数百种。抗生素的发现与应用，改变了现代医学进程，为人类感染性疾病的防治做出了重要贡献。随着抗生素的广泛使用，病原菌对抗生素的耐药性不断增强，抗生素耐药性已成为一个严峻的全球性公共卫生问题[1]。开发能够有效抑制多重耐药菌的新型抗生素迫在眉睫，但新型抗生素的开发非常困难，近30年来人类在新型抗生素的研制方面基本没有突破性发现。许多老品种抗生素仍然是对抗导致许多疾病的病原菌的最佳武器，在今后几十年内它们的临床地位不会有所改变。

在抗生素武器库中，糖肽类和环脂肽类抗生素在治疗耐药菌感染疾病中具有不可替代的作用。糖肽类抗生素是通过非核糖体肽合成的一类抗生素，一般由7个氨基酸组成的环肽母核与2～7糖残基以糖苷键相连接而成，大部分糖肽类抗生素糖基位置含有酰基脂肪酸链[2]。目前临床上使用的糖肽类抗生素有万古霉素、替考拉宁、达巴万星、特拉万星等[3-4]，主要用于治疗包括MRSA在内的革兰阳性菌感染，其中万古霉素曾被誉为治疗耐药革兰阳性菌的最后一道防线[5]。环脂肽类抗生素是由酰基脂肪酸侧链和环肽母核通过1～3个氨基酸组成的线性肽连接构成的一类抗生素，对革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌具有高效广谱的杀菌作用[6-7]。环脂肽多黏菌素B是人类抵御多重耐药革兰阴性细菌的最后一道防线[8]，达托霉素对MRSA、VRSA、VRE和PRSP等高致病革兰阳性临床耐药菌株具有很好的杀菌作用，被誉为“超级抗生素”[9-10]，环脂肽棘白菌素类抗生素卡泊芬净、米卡芬净等用于侵袭性真菌感染的预防和治疗效果显著[11]。

大部分糖肽类和环脂肽类抗生素均含有疏水性酰基脂肪酸链结构，可使其亲脂性增强，更容易与病原菌细胞膜磷脂层结合，从而决定了它们具有良好的抗菌效果。酰基脂肪酸侧链的结构差异对这两类抗生素的理化性质、抗菌活性和细胞毒性影响显著，因此定向改造或强化含特定脂肪酸链组分的糖肽类和环脂肽类抗生素对于进一步开发它们的临床应用具有重要价值。随着分子生物学和基因组学的发展，许多糖肽类和环脂肽类抗生素的生物合成途径与调控机制已经阐明[12-14]，为利用遗传代谢工程针对酰基脂肪酸侧链进行结构改造奠定了基础。本文从糖肽类和环脂肽类抗生素酰基脂肪酸侧链的生源途径、外源添加支链氨基酸组分和内部改造支链氨基酸代谢途径实现对这两类抗生素酰基脂肪酸侧链的组分优化方面进行了系统阐述，以期为这两类抗生素的产量提高与组分优化提供理论参考和技术支撑。

1 糖肽类和环脂肽类抗生素中酰基脂肪酸侧链的生源途径

达托霉素是从玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵产生的环脂肽类抗生素A21978C混合物中分离出的最小组分，A21978C系列混合物母核结构完全一样，不同组分仅在酰基脂肪酸侧链有所不同，达托霉素脂酰基侧链为正癸酰基，A21978C1-C3 3个主要组分的侧链分别为反异十一烷酰基、异十二烷酰基和反异十三烷酰基[15]，见图1。脂酰基侧链对于A21978C的抗菌活性是必须的，A21978C抗菌活性随碳链增长而增加(直到C10)，但碳链长度超过C11时细胞毒性显著增加，综合考虑各组分的抗菌活性与细胞毒性，获得的最佳组分是含有十碳癸酰基的达托霉素。在脂肪酸侧链合成方面，达托霉素生物合成基因簇中并没有发现专门负责脂肪酸合成的基因[16]，脂肪酸侧链来源于细胞初级代谢的脂肪酸合成途径。达托霉素与A21978C1-C3的脂酰基侧链生源途径完全不同，达托霉素的正癸酰基侧链来源于细胞内的直链脂肪酸，直链脂肪酸的合成前体来源于葡萄糖、脂肪和部分氨基酸分解代谢产生的乙酰CoA[17]，而在工业发酵生产中达托霉素癸酰基侧链则主要来源于体外喂养的正癸酸。A21978C1-C3的酰基侧链合成前体来源于支链氨基酸分解代谢产生的脂酰CoA，其中酸缬氨酸在支链氨基酸转氨酶和支链α酮酸脱氢酶复合体的催化下形成异丁酰CoA，进入细胞内脂肪酸合成途径生成A21978C2侧链前体异十二烷酸，异亮氨酸则在支链氨基酸转氨酶和支链α酮酸脱氢酶复合体的作用下转化为α-甲基丁酰CoA，通过细胞内脂肪酸合成途径生成A21978C1和A21978C3的侧链前体反异十一烷酸和反异十三烷酸[18]。

达巴万星是继万古霉素和替考拉宁之后的抗多重耐药革兰阳性菌新型半合成糖肽类抗生素，其前体A40926由野野村放线菌Nonomuraeasp.ATCC39727产生。A40926为一组结构相近的化合物组成的复合物，各化合物均含有交联七肽架构、两个氯原子、一个甘露糖和一个脂肪酸侧链，区别仅在于疏水性酰基脂肪酸链不同，其中组分B0和A0的脂酰基侧链分别为异十二烷基和异十一烷基，而组分B1和A1的脂酰基侧链则分别为正十二烷基和正十一烷基[19-20]，见图2。研究表明，脂酰侧链与A40926的抑菌活性有关，然而在A40926生物合成基因簇亦不含参与脂酰长链合成的相关基因[21]，脂肪酸侧链可能来源于细胞初级代谢的脂肪酸合成途径。Jovetic等[22]研究发现，A40926各组分的比例与其产生菌Nonomuraeasp.ATCC39727细胞脂肪酸组成在量上存在一致性，由此推测可能是细胞长链脂肪酸经β-氧化后生成A40926各化合物的脂肪酸链，而支链氨基酸则作为细胞脂肪酸合成的前体物间接参与了A40926的生物合成。张广昊等[23]也证明了Nonomuraeasp.ATCC39727细胞脂肪酸和A40926化合物的脂侧链之间存在内在关联。

纽莫康定B0是由丝状真菌Glarea lozoyensis通过NRPS-PKS杂合途径生成的一种环脂肽抗生素，其半合成衍生物卡泊芬净是第一个用于治疗人类侵入性真菌感染的的棘白素类抗真菌药物。纽莫康定B0由一个核心结构环状六肽母核和一个十六碳的脂肪酸侧链组成，非核糖体肽基因簇GLNRPS4和聚酮基因簇GLPKS4分别负责环状六肽母核和十六碳脂肪酸链的生物合成[24-25]。G.lozoyensis除能合成主产物B0外，还能产生A0，C0等一系列十多种类似物，它们与B0的区别体现在氨基酸侧链的不同修饰上，但其脂肪酸侧链均为10, 12-二甲基肉豆蔻酸。肉豆蔻酸由GLPKS4编码的聚酮合酶缩合乙酰CoA而成，并非来自于细胞初级代谢的脂肪酸合成途径和外源喂养途径[25-26]。

2 外源添加支链氨基酸对糖肽类和环脂肽类抗生素产量和组分的影响

替考拉宁是由替考游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)产生的一种糖肽类抗生素，结构中含有7个氨基酸、3个糖基和1个脂酰基侧链。替考拉宁由五个结构相似的化合物TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4和TA2-5组成，差异仅表现在脂酰基侧链的不同，但都是替考拉宁的有效组分，其中TA2-2为主要组分[27]，图3。亚油酸和油酸分别是TA2-1和TA2-3线性脂肪酸侧链的合成前体，L-缬氨酸是TA2-2脂肪酸侧链8-甲基壬酸的合成前体，亮氨酸和异亮氨酸则分别是TA2-4和TA2-5的脂肪酸侧链的合成前体[28-29]。王明蓉等[30]报道在替考拉宁发酵过程中添加0.06%的缬氨酸可显著提高主要组分TA2-2的含量。王会会等[31]报道在替考拉宁生物合成过程中添加0.06%的缬氨酸和0.75%的大豆油，替考拉宁产量可提高47.2%，各组分含量均符合质量要求，其中主要成分A2-2含量达到53.1%。

多黏菌素B是由多黏类芽胞杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的一种碱性环脂肽类抗生素，是由B1、B1-Ile、B2、B3、B4、B5和B6 7种组分构成的混合物，各组分的差异仅在酰基脂肪酸链部分的变化和7位氨基酸的不同(亮氨酸或异亮氨酸)[32]，主要组分为B1、B2、B3和B1-Ile，图4。根据《中国药典》种对多黏菌素B的含量限度要求，B3含量不得超过6.0%，B1-Ile含量不得超过15.0%，B1、B2、B3 和B1-Ile总含量不得少于80%[33]。B1和B1-Ile酰基脂肪酸为6-甲基辛酸(MOA)，B2酰基脂肪酸为异辛酸(IOA)，MOA和IOA的合成分别起始于异亮氨酸和缬氨酸的分解代谢。在多黏菌素B生物合成过程中，亮氨酸主要作为前体氨基酸，异亮氨酸的分解代谢产物则主要参与B1脂肪酸侧链合成。吴恩国等[34]报道了在多黏菌素B发酵过程中添加0.08%的亮氨酸，0.08%异亮氨酸和0.05%苯丙氨酸时，可使主要组分B1在复合物中的质量分数达到80%以上，有效控制和优化了多黏菌素B的发酵组分。

在A40926多组分混合物中，主要组分B0脂肪酸侧链酸来源于产生菌细胞长链脂肪酸异十六烷酸的β-氧化降解，而异十六烷酸的合成起始于缬氨酸的分解代谢，因此缬氨酸对A40926的效价和组分有影响显著。Selva等[35]报道了在A40926发酵过程中，添加缬氨酸或异丁醇可选择性提高B0组分的产量。Beltrametti等[36]报道了在Nonomuraeasp.ATCC39727基础培养基P150中加入0.2%的L-缬氨酸，可显著提高B0因子的浓度和比例，其中B0:B1组分比例从1:1上升至10:1。达托霉素发酵过程具有前体导向的特征，即在发酵过程中添加不同的前体物质，可显著提高A21978C混合物中其相应组分的含量，当添加缬氨酸时A21978C2组分的含量大幅提高，当添加异亮氨酸时A21978C1和A21978C3的含量提高，当添加亮氨酸时产生两种新组分X和Y，而在发酵过程中添加癸酸时则可以能够显著提高达托霉素产量[37]。

3 内部改造支链氨基酸代谢途径对糖肽类和环脂肪肽类抗生素产量和组分的影响

支链脂肪酸的生物合成以支链脂酰CoA作为起始单元，而支链脂酰CoA由支链氨基酸分解代谢产生。

支链氨基酸分解代谢首先在支链氨基酸转氨酶(branched-chain amino acid aminotransferase, BCAT)的作用下经可逆的转氨基作用形成相应的支链-α酮酸，其中缬氨酸生成α-酮异戊酸、亮氨酸生成α-酮异己酸、异亮氨酸生成α-酮基-β-甲基戊酸。支链-α酮酸再经支链α酮酸脱氢酶复合体(branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex, BCKD)催化进行不可逆的氧化脱羧，形成少一个碳原子的支链脂酰CoA, 如异丁酰-CoA(Isobutyryl-CoA)、异戊酰-CoA(Isovaleryl-CoA)和2-甲基丁酰CoA(2-methylbutyryl-CoA)[38]。支链脂酰CoA再经一系列酶的催化作用，在脂酰CoA的α，β原子间脱氢形成双键，在双键间加水形成β-羟酰基CoA等，最终缬氨酸降解为琥珀酰CoA，异亮氨酸降解为丙酰CoA和乙酰CoA，亮氨酸降解为乙酰乙酸和乙酰CoA (图5)。异丁酰-CoA、异戊酰-CoA和2-甲基丁酰CoA等支链脂酰CoA亦可经细胞脂肪酸合成酶系(Fatty acid synthase，FAS)作用生成奇数碳或偶数碳支链脂肪酸，还可作为很多聚酮类化合物生物合成的重要前体 (图6)[39]。

BCKD是一种广泛存在于生物体内并参与支链氨基酸降解的关键酶，能不可逆催化支链-α酮酸氧化脱羧，也是支链脂肪酸初步合成的重要酶。BCKD是由脱羧酶(E1，包括E1α、E1β两个亚单位)、二氢硫辛酰胺酰基转移酶(dihydrolipoyltransacetylase，E2)和二氢硫辛酰胺酰基脱氢酶(dihydrolipoyldehydrogenase，E3)4种功能性组分组成的多酶复合体，E1α、E1β、E2编码基因一般成簇地分布在生物体基因组中，而E3编码基因则分布在基因簇以外的染色体其它区域。细菌基因组中通常仅含有一套BCKD编码基因簇，而链霉菌中一般含有两套BCKD编码基因簇，其中一套基因簇起主导作用，另一套则起辅助作用或为沉默基因簇。在天蓝色链霉菌S.coelicolor中报道了两套BCKD编码基因簇bkdA1B1C1和bkdA2B2C2，其中bkdA1B1C1在菌丝形态发育和抗生素生物合成上发挥着重要作用，当bkdA1B1C1被阻断后，突变株内几乎不产支链脂肪酸且不能在以支链氨基酸为唯一碳源的培养基上生长[40-41]。I型聚酮化合物阿维菌素的生物合成起始单元由异亮氨酸或缬氨酸降解转化而来，当其产生菌S.avermitilis中的BCKD编码基因簇bkdFGH敲除后，突变株由于起始单元合成能力丧失而失去阿维菌素合成能力，而敲除另一BCKD编码基因簇bkdABC并不影响阿维菌素的合成。当向bkdFGH敲除突变株补加异丁酸或2-甲基丁酸时则又可恢复阿维菌素合成，而单独添加环己羧酸发酵后则可产生杀菌活性更强的多拉菌素。说明支链氨基酸代谢在S.avermitilis聚酮产物生物合成过程中扮演了提供前体的重要角色[42-43]。

随着高通量测序和生物信息技术的不断发展，越来越多的糖肽类和环脂肽类抗生素产生菌全基因组序列得以测定和解析，BCKD基因簇作为这两类抗生素酰基脂肪酸侧链生物合成途径中的重要遗传因子，在复杂的代谢与调控网络中起着至关重要的作用。对糖肽类和环脂肽类抗生素产生菌BCKD基因簇进行克隆与功能分析，有助于我们通过菌种基因工程改造以降低产生菌中含支链脂肪酸侧链的组分的比例，提高含直链脂肪酸侧链组分的含量。罗帅等[44]通过基因敲除和回补的遗传手段研究了达托霉素产生菌S.roseosporus中BCKD基因簇bkdA1B1C1(MG324008)和bkdA2B2C2(MG324007)在达托霉素同系物A21978C1-C3生物合成中发挥的具体作用，研究发现，bkdA1B1C1敲除突株不再生成同系物A21978C1-C3，而bkdA2B2C2敲除突变株A21978C1-C3下降程度并不明显，说明了S.roseosporus中A21978C1-C3支链脂肪酸前体的合成，几乎全部依赖于bkdA1B1C1主导催化的缬氨酸和异亮氨酸的分解代谢，bkdA2B2C2只是辅助基因簇。进一步基于支链氨基酸的分解代谢途径，构建了同时敲除bkdA1B1C1/bkdA2B2C2基因簇的工程菌，在不影响达托霉素发酵效价的前提下特异性地消除了3个主要同系物副产物A21978C1-C3生成，实现了达托霉素的优质高效生产。这是基于内部支链氨基酸代谢途径改造实现对环脂肪肽类抗生素组分优化的典型成功案例，可为其他糖肽类和环脂肽类抗生素的产生菌种基因工程改造提供重要的参考。

4 结语与展望

在许多抗生素生物合成过程中，产生菌往往产生以一种组分为主要活性成分的多组分混合物，这种多组分现象给目标产物的分离纯化、药品标准制定和生产质量控制带来很大的困难与挑战。筛选和构建主产单一高活性组分的优良生产菌株，对于提高发酵类抗生素药品安全性、有效性和标准水平具有十分重要的意义。在糖肽类和环脂肽类抗生素中，酰基脂肪酸侧链的差异是导致这两类抗生素多组分现象主要原因，有针对性地强化或定向改造含特定脂肪酸链组分的糖肽类和环脂肽类抗生素对于促进它们的临床应用具有重要价值。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸三种支链氨基酸的分解代在糖肽类和环脂肽类抗生素酰基脂肪酸侧链的生物合成过程中发挥着重要作用，对这两类抗生素的发酵效价高低与发酵组分差异有着显著影响。通过向培养基中添加特异性支链氨基酸，经分解代谢后可为糖肽类和环脂肽类抗生素的酰基脂肪酸侧链提供更多的脂酰CoA前体，从而促进目标组分产量与组分的提高。随着糖肽类和环脂肽类抗生素生物合成机制的深入解析及支链氨基酸分解代谢有关基因的克隆与功能鉴定，亦为代谢工程改造内部支链氨基酸代谢途径以实现对这两类抗生素酰基脂肪酸侧链结构的定向控制与人工调控奠定了基础。