磷酸酶和张力蛋白同源物在创伤性颅脑损伤患者外周血单个核细胞中的表达及与神经功能恢复的关系

丁锦荣，管义祥，刘小江

南通大学附属海安医院神经外科，江苏 南通 226600

颅脑损伤是临床中发病率较高的创伤类型，病死率居所有创伤首位[1]。据相关研究报道[2]，我国每年约60万例颅脑损伤发生，病死率65%～80%。神经功能恢复与创伤性颅脑损伤患者的预后有关，脑部神经功能恢复越差，预后也越差[3-4]。目前临床中尚缺乏对创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复状况进行预测的特异性标志物。基础医学研究报道[5]，磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologues，PTEN)在间充质干细胞外分泌体中的表达与海马区神经干细胞的增殖能力有关，可通过调控多种细胞间的信号传导促进细胞凋亡，推测PTEN在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中的表达可能参与脑损伤的病理过程。目前PTEN在创伤性颅脑损伤患者PBMC中的表达及与神经功能恢复的关系尚不清楚。本研究前瞻性研究2019年6月—2021年5月笔者医院收治的创伤性颅脑损伤患者临床资料，探讨PTEN在创伤性颅脑损伤患者PBMC中的表达及与神经功能恢复的关系。

资料与方法

1 一般资料

纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)经影像学检查确诊为颅脑损伤[6]；(3)格拉斯哥昏迷评分(Glasgow coma score，GCS)3～11分；(4)受伤至入院治疗时间<12h。排除标准：(1)脑疝或恶性肿瘤；(2)免疫系统或代谢功能障碍；(3)合并其他部位损伤；(4)心、肝、肾、免疫系统或血液系统等严重疾病；(5)合并血液系统疾病或凝血功能障碍；(6)既往脑创伤史；(7)精神疾病。

本组创伤性颅脑损伤患者(82例)、健康志愿者(75例)，分别记为脑伤组和健康对照组。脑伤组男性54例，女性28例；年龄31～64岁，平均53.1岁。健康对照组男性42例，女性33例；年龄32～68岁，平均55.5岁。本研究患者及家属均签署知情同意书，获笔者医院医学伦理委员会批准(JCZ21028)。

2 PBMC分离及PTEN mRNA表达检测方法

采集所有研究对象外周血10mL(创伤性颅脑损伤患者于入院后治疗前、健康者于体检当天)，使用PBMC分离液分离PBMC(北京康瑞纳生物科技有限公司)，用于逆转录-聚合酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测。提取PBMC总RNA，反转录为cDNA，设计PTEN和内参基因β-actin上下游引物，PTEN上游引物：5’-GGGCTAGTTTGCAAAGTTT-3’，下游引物：5’-ACATTTCGCTAGCCTGAAAT-3’，产物长度125 bp；β-actin上游引物：5’-ATTGCATTTGCATTCTGAC-3’，下游引物：5’-GCCATGGTGAGCGTATTAC-3’，产物长度118 bp；引物序列、大小均由上海生工生物公司合成。按反应条件进行扩增：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；72℃，30s；40个循环。根据2-△△Ct计算PTEN mRNA相对表达量。

3 治疗方法

依据《颅脑创伤和脑科危重症治疗学》[7]，给予创伤性颅脑损伤患者降低颅内压、营养支持及通气等规范治疗。

4 资料收集

收集可能影响创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复的相关因素，主要包括性别、年龄、体质量指数(BMI)、受伤至入院治疗时间、住院时间、吸烟史、饮酒史、是否为开放性损伤、是否合并糖尿病、高血压、高血脂症、是否进行手术、致伤原因、颅脑损伤严重程度、合并疾病数量、GCS[8]、昏迷时间及PTEN mRNA。

5 观察指标

(1)比较两组研究对象临床资料及PTEN mRNA在PBMC中的表达；(2)治疗1个月后统计创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复情况，采用改良Rankin量表(modified rankin scale，mRS)[9]对创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复情况进行评定，并分为恢复良好组(mRS评分0～2分)和恢复不良组(mRS评分3～6分)；(3)比较恢复良好组和恢复不良组患者的临床资料；(4)Logistic回归分析影响创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复的危险因素；(5)分析PTEN mRNA对创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复不良的预测效能。

6 统计学分析

结 果

1 两组研究对象临床资料及PTEN mRNA在PBMC中的表达比较

两组研究对象性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)；脑伤组PTEN mRNA高于健康对照组(P<0.05)。见表1。

2 创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复情况

本组82例创伤性颅脑损伤患者，21例患者神经功能恢复不良，神经功能恢复不良发生率25.61%。

3 恢复良好组和恢复不良组患者临床资料比较

恢复不良组住院时间、开放性损伤占比、进行手术占比、重度颅脑损伤占比、昏迷时间及PTEN mRNA均多于恢复良好组(P<0.05)，GCS则低于恢复良好组(P<0.05)。见表2。

4 影响创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复的危险因素

以住院时间、GCS、昏迷时间、PTEN mRNA(均为连续变量)、开放性损伤(否=0，是=1)、进行手术(否=0，是=1)、颅脑损伤严重程度(重度=0，轻中度=1)为自变量，创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复情况为因变量，恢复不良=1，恢复良好=0，进行Logistic回归分析，多因素分析结果显示，重度颅脑损伤、GCS及PTEN mRNA均为影响创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复的危险因素(OR=2.852、3.374、4.011，P<0.05)。见表3。

5 PTEN mRNA对创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良的预测效能

ROC曲线分析显示，PTEN mRNA对创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良预测的最佳截断点1.72，灵敏度71.43%，特异度80.33%，AUC值0.784。见图1。

表1 两组患者临床资料及PTEN mRNA在PBMC中的表达比较

表2 恢复良好组和恢复不良组患者临床资料比较

表3 影响创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复的多因素Logistic回归分析

ROC：受试者工作特征

讨 论

颅脑损伤指头部由于遭受外界剧烈、严重伤害所导致的脑挫裂伤、颅内水肿等，近年来随着交通事故的频发，创伤性颅脑损伤的发生率呈逐年升高趋势[10-11]。颅脑损伤具有并发症多、致残病死率高等特点，严重影响了患者预后。据相关研究表明[12]，颅脑损伤患者神经功能恢复与预后密切相关。目前临床中尚缺乏对颅脑损伤患者神经功能恢复进行有效评估预测的高特异性标志物，探讨PTEN在创伤性颅脑损伤患者PBMC中的表达及与神经功能恢复的关系具有十分重要的临床意义。

本研究结果显示，脑伤组PTEN mRNA高于健康对照组，提示相比健康者，创伤性颅脑损伤患者PTEN mRNA异常偏高。PTEN为具有蛋白性和脂性双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，主要分布于细胞核和细胞质中。既往研究表明[13-14]，PTEN参与多种细胞间的信号传导，其可通过磷酸化调控与受体结合，形成复杂的调节网络，与神经元的凋亡密切相关，在中枢神经系统损伤防护、再生中具有重要作用。本研究中创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良发生率25.61%，提示创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良发生率较高，本研究结果与朱辉和周树生[15]研究结果相近。本研究结果表明，恢复不良组住院时间、手术治疗占比、开放性损伤占比、重度颅脑损伤占比、昏迷时间及PTEN mRNA均多于恢复良好组，GCS则低于恢复良好组。经Logistic回归分析结果显示，重度颅脑损伤、GCS及PTEN mRNA均为影响创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复的危险因素，提示重度颅脑损伤、GCS及PTEN mRNA均为影响创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复的危险因素，临床中需逐一控制各项因素对创伤性颅脑损伤患者的影响，以降低神经功能恢复不良的发生率。重度颅脑损伤、GCS均与创伤性颅脑损伤患者的病情直接相关，可直接影响患者神经功能的恢复[16-17]。PTEN所编码的蛋白质与中枢神经系统神经干细胞的增殖、分化能力有关，据相关研究报道[18]，PTEN可通过调控相关通路活性影响mTOR等下游关键分子的表达，近而抑制神经元再生，并可阻碍神经损伤后的再生修复。ROC曲线分析显示，PTEN mRNA对创伤性颅脑损伤患者的神经功能恢复不良预测的最佳截断点1.72，灵敏度71.43%，特异度80.33%，AUC值0.784，提示PTEN mRNA可作为预测创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良的重要参考指标。本研究创新之处在于有针对性的对创伤性颅脑损伤患者PTEN在PBMC中的表达进行分析，并探讨PTEN与神经功能恢复的相关性，以期通过PTEN表达情况对该类患者神经功能恢复状况进行评估。

综上所述，PTEN在创伤性颅脑损伤患者PBMC中的表达与神经功能的恢复存在一定的相关性，PTEN mRNA可作为预测创伤性颅脑损伤患者神经功能恢复不良的重要参考指标，建议在临床中对创伤性颅脑损伤患者PBMC中PTEN mRNA的表达进行监测，以降低神经功能恢复不良的发生率。

作者贡献声明：丁锦荣：论文修改及审校、资料搜集、论文撰写；管义祥：研究指导、论文修改、经费支持、病例随访、数据整理；刘小江：资料收集、论文撰写、文献检索、病例资料整理及统计学分析/研究(内容)设计