巨大芽孢杆菌中芥酸酰胺测定方法的建立及发酵条件优化

汤鑫鑫， 谢毓丹， 肖 洋， 孙 冉， 李 祝， 邓 丽， 姚蒋庞

(1. 贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵阳 550025； 2. 贵州省产品质量检验检测院，贵阳 550003)

芥酸酰胺(Erucamide，Eru)，学名：(Z)-docos-13-enoic acid)，分子式CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11CONH2，化学结构式如图1所示。芥酸酰胺是由不饱和脂肪酸(芥酸)所生成的一种具有生物活性的长链不饱和脂肪酸酰胺，超长碳链结构赋予了它特别的表面性能和高温性能，被广泛应用于塑料、工程塑料、化妆品、医药、环保涂料、造纸、食品包装等领域[1-3]。对芥酸酰胺的研究，国内主要集中在其测定方法及其制备[4-6]等，国外也是对其测定方法[7-8]以及减小摩擦因数性能[9-10]的研究居多。虽然芥酸酰胺所有确切的生物学功能尚未明确，但是已有研究发现从血浆中分离得到作为水平衡器的芥酸酰胺，可以抑制肠道腹泻，也可以调节其他器官的液体量[11]。Wakamatsu等[12]研究发现芥酸酰胺是牛肠系膜血管生成的主要脂类，能引起血管生成。Li等[13]研究表明口服芥酸酰胺(5～20 mg/kg)可减轻小鼠抑郁、焦虑样行为。此外，研究发现从浮萍根中分离得到的芥酸酰胺能促进荧光假单胞菌脱氮，促进硝酸还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性[14-15]。

芥酸酰胺主要以高芥酸(>50%)的菜籽油为原料制备，其制取方法有芥酸氨化法、芥酸甲酯氨化法、芥酸酰氯氨化法、芥酸酸酐氨化法、芥酸-酰胺置换法、芥酸腈水解法以及高芥酸菜籽油直接氨解法等[16]。目前，国内外对与芥酸酰胺的检测主要采用气相色谱法(GC)[17]、高效液相色谱法(HPLC)[18-19]、GC-MS[20-22]、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[23]和红外光谱法(FT-IR)[24]。每种方法都有不足之处：HPLC检测芥酸酰胺含量时，紫外检测器吸收弱、检测灵敏度低；GC-MS测定芥酸酰胺含量时检出限很高；FT-IR定量分析芥酸酰胺含量时误差较大[25]。目前尚无有关微生物源芥酸酰胺的方法建立和其发酵生产的报道。

实验室在前期工作中从巨大芽孢杆菌L2中分离得到芥酸酰胺，证实该菌株可以产生芥酸酰胺[26-27]，但还未建立其检测方法。研究在建立芥酸酰胺测定方法的基础上，采用单因素试验和响应面分析法，对其培养基成分和发酵条件进行研究，不仅为芥酸酰胺微生物来源含量提供依据，还为芥酸酰胺生物源生产提供理论依据和研究基础。

图1 芥酸酰胺的化学结构式Figure 1 Chemical structure formula of erucamide

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培养基

巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium) L2，由贵州大学真菌资源研究所分离、筛选并鉴定，现保藏于中国典型培养物保藏中心(China center for type culture collection，CCTCC) (武汉大学)，保藏号：CCTCC No. M2012381。

斜面培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂20 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2；种子培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2；发酵培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.2 仪器与设备

BIOMATE 3S 紫外分光光度计，美国Thermo Fisher公司；HP6890/5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，美国安捷伦公司；FA2204N 精密电子天平，上海菁海科技有限公司；Allegra X-30R 离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；SUKUN(SKY-2112B)立式双层特大容量恒温培养摇床，上海达平仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与培养

种子培养：将保藏的菌种接入到含有40 mL种子培养基的三角瓶(100 mL)中，30 ℃，150 r/min，培养12 h。

发酵培养：将发酵好的种子液以2%的接种量接入到含有50 mL发酵培养基的三角瓶(100 mL)中，摇床转速150 r/min，30 ℃发酵培养。

1.2.2 标准储备液的配制

准确称取芥酸酰胺标准品1 mg，用1 mL热甲醇溶解，所得质量浓度为1 mg/mL。将标准储备液用二氯甲烷稀释成质量浓度分别为5、10、20、40和60 μg/mL标准溶液，按上述条件进行测定。以质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标作图绘制芥酸酰胺GC-MS标准曲线。

1.2.3 菌体生长量的测定

菌体浓度用在600 nm波长下分光光度计检测的吸光度OD600表示。

1.2.4 芥酸酰胺含量的测定

巨大芽孢杆菌的种子液按2%接种到发酵培养基中(50 mL/100 mL)，30 ℃，150 r/min，培养2 d。菌悬液10 000 r/min离心10 min，上清液即为发酵液。发酵液与二氯甲烷按体积比1∶1进行萃取2 h，每隔15 min剧烈振荡后静置分层，将有机相(下层)于旋转蒸发仪浓缩干燥，再用2 mL二氯甲烷溶解，吸取适量溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，置4 ℃冰箱备用，待后续进行GC/MS分析。

GC/MS色谱条件：Agilent，HP-5型色谱柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，进样口温度290 ℃[28]。起始柱温：150 ℃，保持 2 min，以20 ℃/min升温至300 ℃保持3 min，载气为He，流速1.0 mL/min，进样量为1 μL。

1.2.5 单因素试验

在基础发酵培养基的基础上，以菌体生长和芥酸酰胺产量作为评价指标，对碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇)、碳源添加量(1、5、10、15和20 g/L)、氮源(酵母浸膏、尿素、硫酸铵、胰蛋白胨、蛋白胨)、氮源添加量(1、5、10、15和20 g/L)、无机盐添加量(1、3、5、7和9 g/L)、接种量(1、3、5、7和9 g/L)、温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)、摇床转速(100、120、150、180和210 r/min)、pH值(4.0、6.0、7.0、8.0和10.0)进行单因素试验优化，分别考察各因素对L2菌株生长情况和产芥酸酰胺的影响。

1.2.6 响应面试验

根据单因素试验结果，采用三因素三水平Box-Behnken中心组合试验设计，以L2菌株发酵液中芥酸酰胺的产量为响应值，将蛋白胨添加量、温度、pH值3个因素作为自变量，用软件Design Expert 8.06对数据进行响应面分析，进而确定L2菌株产芥酸酰胺的最佳发酵培养基与发酵条件。

2 结果与分析

2.1 芥酸酰胺测定方法的建立

2.1.1 标准曲线及线性关系的考察

以芥酸酰胺标准溶液质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标制作芥酸酰胺标准曲线，结果见图2。由图2可知，芥酸酰胺标准曲线线性回归方程为y= 31 452x+ 12 811，相关系数R2= 0.997 4，芥酸酰胺质量浓度在5～60 μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系，能够满足样品测试要求。

图2 芥酸酰胺标准曲线Figure 2 Standard curve of erucamide

2.1.2 精密度试验

取20 μg/mL芥酸酰胺对照品溶液，按1.2.4色谱条件连续进样8次，得到对照品峰面积，精密度试验结果见表1。芥酸酰胺含量结果RSD为5.74%，结果表明该方法精密度高。

表1 精密度试验结果

2.1.3 重复性试验

平行取同一批次发酵液6份，按1.2.4制备供试品溶液8份，再按色谱条件进样，得到对照品峰面积，结果见表2。芥酸酰胺含量测定结果RSD值为8.38%，考察的芥酸酰胺含量测定结果RSD值均小于15%，表明该检测方法重复性良好。

表2 重复性试验结果

2.1.4 稳定性试验

取同一份供试品溶液，按照1.2.4方法操作制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10和12 h按照色谱测定方法进样，记录峰面积，计算芥酸酰胺含量的RSD，结果见表3。芥酸酰胺含量测定结果RSD值为3.67%，考察的芥酸酰胺含量测定结果RSD值均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.1.5 回收率试验

取已知含量的发酵液9份，分别按照低、中、高 3种浓度水平加入芥酸酰胺对照品溶液，按1.2.4方法处理后，各浓度水平平行测定3次(表4)。由表4可知，样品平均加标回收率为82.78%～98.14%，表明该方法准确度良好。

表4 回收率试验结果

2.1.6 样品测定

芥酸酰胺标准品GC-MS色谱图(图3)，由图3可知，芥酸酰胺的保留时间为8.041 min。

图3 芥酸酰胺标准品(40 μg/mL)GC-MS色谱图Figure 3 GC-MS chromatogram of erucamide standard substance(40 g/mL)

巨大芽孢杆菌发酵液样品中芥酸酰胺含量分析GC-MS色谱图(图4)。由图4可知，芥酸酰胺的保留时间为8.037 min，巨大芽孢杆菌发酵液样品中的芥酸酰胺含量为0.940 mg/L。

图4 巨大芽孢杆菌L2发酵液样品中芥酸酰胺含量GC-MS色谱图Figure 4 GC-MS chromatogram of erucamide content in fermentationbroth of B. megaterium L2

2.2 单因素试验结果

分别考察不同碳源、碳源添加量、氮源、氮源添加量、无机盐添加量、接种量、温度、转速、初始pH值对菌株生产量和芥酸酰胺产量的影响，结果如图5。碳源可以为微生物提供生命活动所需要的能量，分别选用10 g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇代替基础培养基中的葡萄糖作为唯一碳源[图5(a)]，再进行最佳碳源添加量的筛选[图5(b)]。从图5(a)明显看出葡萄糖对L2菌株的生长和芥酸酰胺的产生有显著差异(P<0.05)，芥酸酰胺产量为1.027 mg/L±0.031 mg/L，其添加量为5 g/L时芥酸酰胺含量最高(1.045 mg/L±0.02 mg/L)。氮源是构成微生物细胞物质和含氮代谢物的重要来源，选择10 g/L的酵母浸膏、尿素、硫酸铵、胰蛋白胨和蛋白胨作为氮源进行筛选[图5(c)]，再进行最佳碳源添加量的筛选[图5(d)]。从图5(c)发现无机氮(尿素和硫酸铵)不利于L2菌株的生长，芥酸酰胺产量低；有机氮(酵母浸膏、胰蛋白胨和蛋白胨)有利于菌体生长和芥酸酰胺的产生，尤其是蛋白胨(P<0.05，1.023 mg/L±0.028 mg/L)，当其添加量为15 g/L时产芥酸酰胺含量最多(1.17 mg/L±0.053 mg/L)。无机盐对微生物的正常生长发育和次级代谢产物的合成具有相当重要的影响，3 g/L的NaCl添加量不仅利于菌体产生芥酸酰胺(1.124 mg/L±0.0285 mg/L)，还可以节约成本，所以3 g/L作为无机盐最佳添加浓度[图5(e)]。

图5 单因素对芥酸酰胺产量的影响Figure 5 Effect of single factor on yield of erucamide

接种量过少，迟缓期较长；接种量过高，种内竞争增加，因此，合适的接种量有利于代谢产物合成[29-30]，从图5(f)发现接种量为2%～6%时，对菌体的生长和芥酸酰胺的产生无显著差异，但2%接种量产芥酸酰胺含量达1.135 mg/L±0.041 mg/L[图5(f)]。温度通过酶的活性影响微生物的生长和代谢产物的积累[31]，从图5(g)中明显看出温度过高过低都会影响菌株的生长状况，不利于芥酸酰胺的产生，35 ℃时菌株生长量和产芥酸酰胺含量显著高于其他处理(P<0.05)，产量为1.727 mg/L±0.034 mg/L。转速较小时，空气流通量较小，不利菌体生长；转速过大，相应的剪切力增加，会对菌体造成伤害，产量减少[32]。pH值对菌体生长量和芥酸酰胺的产生有显著影响[图5(h)]，随着初始pH值的增加，该菌株的生长量和芥酸酰胺产量均呈先递增后下降的趋势，表明pH值6.0～8.0利于菌体生长和芥酸酰胺产生，但pH值为6.0时菌体生长量和产芥酸酰胺的产量最大(1.207 mg/L±0.027 mg/L)，因此最佳pH值为6.0。从图5(i)看出，随摇床转数增加，该菌株的芥酸酰胺产量呈先增后降的趋势，摇床转速150 r/min时，芥酸酰胺产量达到最大(1.215 mg/L±0.035 mg/L)。初始pH值通过改变酶的活性、细胞质膜通透性、膜结构稳定性和物质溶解性等方面来影响微生物的生长和产物积累[33]。

2.3 L2产芥酸酰胺的响应面优化结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验，采用Box-Behnken试验对产芥酸酰胺发酵培养基和培养条件进行三因素三水平的响应面分析，以蛋白胨添加量(A)、温度(B)、pH (C) 3个因素为自变量，芥酸酰胺含量为响应值。这3个因素作为变量，每个变量按低、中、高3个水平分别以-1、0、1进行编码。由Design Expert软件设计了17个响应分析试验，试验设计因素及水平见表5，试验设计及结果见表6。

表5 Box-Behnken试验设计因素和水平

采用Design Expert软件对表2数据进行多元回归拟合分析，得到芥酸酰胺含量为响应值的回归方程：Y=1.27+0.08A-0.014B-0.043C+0.040AB-0.029AC+0.027BC-0.15A2-0.093B2-0.12C2。

表6 Box-Behnken试验设计与结果

2.3.2 回归模型方差分析

对上述回归方程进行方差分析，结果见表7。分析表7的结果可知决定系数与矫正决定系数为0.999和0.998，说明自变量与因变量线性关系显著，二值较为接近，表明模型较准确地反映了芥酸酰胺的产量与蛋白胨添加量(A)、温度(B)、pH(C)之间的关系，且后续预测值在可信区间内；此外，模型P<0.05(显著)，失拟项P=1.32>0.05(不显著)，说明模型可较好拟合试验数据，试验误差较小；模型变异系数CV=4.71%<10.0%，说明本次响应面试验的可信度和精确度较高。综上，该模型可用于本次试验。F检验可用于判定各变量对响应值影响的显著性，P值越小显著性越高[34-35]。由回归方程系数显著性检验可知：模型中一次项A极显著(P<0.01)，B、C不显著(P>0.05)，3个因素对菌株L2产芥酸酰胺能力的影响从大到小依次为A>C>B。二次项A2、B2和C2极显著(P<0.01)；交互项AB、AC、BC均不显著(P>0.05)，表明3个因素对芥酸酰胺的产生有显著影响，但它们之间的交互影响不显著。

表7 回归方程方差分析结果

2.3.3 等高线图与响应曲面

根据回归方程画出蛋白胨添加量(A)、温度(B)、pH(C)交互作用的等高线图和响应曲面(图6)。不同因素交互效应的强弱可以通过等高线的形状进行判定，椭圆形表示两因素交互作用显著，圆形则表示两因素交互作用不显著。数学模型分析得菌株L2产芥酸酰胺的最佳培养条件：pH值为5.79、蛋白胨添加量为16.37 g/L，温度为34.76 ℃，理论响应值为1.284 mg/L。结合实际操作方便性和方差分析结果，确定最佳发酵条件：初始pH值为5.80、蛋白胨添加量为16.40 g/L，温度为34.8 ℃。

图6 蛋白胨添加量、温度、pH值对芥酸酰胺产量影响的响应曲面与等高线Figure 6 Response surface and contour plots for the effects ofpeptone concentration, temperature and pH on the yield of erucamide

2.3.4 验证试验

在最优发酵条件下，重复3次摇瓶实验以验证预测值，最佳培养条件进行3次平行试验验证，结果的平均值为1.325 mg/L，与理论响应值(1.284 mg/L)相差0.041 mg/L。经验证，响应面试验结果真实可靠。最终结果显示，优化后的芥酸酰胺产量较优化前(0.953 mg/L)提高了39.03%。

3 讨论与结论

建立GC-MS法检测巨大芽孢杆菌发酵液中芥酸酰胺含量的分析方法，该方法灵敏度高、操作简便。结果显示：GC-MS法检测的RSD值均小于15%，样品平均加标回收率在82.78%～98.14%，满足方法检测要求，为今后探索巨大芽孢杆菌发酵液中物质有一定的参考作用，为微生物源芥酸酰胺含量的测定提供有效的分析方法。

科学的培养基成分和培养条件不仅促进菌体快速生长繁殖，增强微生物的代谢性能，还能提高能源利用率，降低生产成本。现代数学中的很多统计优化技术逐渐渗透到微生物发酵工艺优化中[36]。张玲玲等[37]应用响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌产乙偶姻发酵条件，优化后菌株摇瓶发酵ACT的平均产率为25.60 g/L，比优化前菌株ACT产率提高了39.36%。张健等[38]在单因素试验的基础上，采用响应面法优化茴香酸生产菌发酵条件，优化后茴香酸生成量为7.24 g/L,为优化前的3.5倍。宫恺[39]利用响应面法优化大肠杆菌产5-氨基乙酰丙酸(ALA)发酵条件，通过优化后发酵条件进行5 L发酵罐培养获得ALA的最高产量达到5.3 g/L,比实验室先期发酵条件优化的5 L发酵罐发酵ALA的产量提高了1.3倍左右。响应面法优化实验次数少、周期短、精度高，已成功应用于各种发酵培养基的优化，多数应用于提高目标产物产量，但目前还未有将该方法应用于巨大芽孢杆菌产芥酸酰胺的发酵培养的报道。

在建立的测定方法基础上，采用单因素试验和响应面设计方法优化巨大芽孢杆菌L2产芥酸酰胺的发酵培养基和发酵条件，得到优化培养基和培养条件：葡萄糖浓度为5 g/L、蛋白胨添加量为16.40 g/L、NaCl添加量为3 g/L、接种量为2.0%、培养温度为34.8 ℃、摇床转速为150 r/min、初始pH值为5.80，优化后芥酸酰胺产量较原始发酵条件提高了39.03%，实测值与响应面预测值吻合良好。