1H NMR对烟草甲虫蛀蚀款冬花前后化学成分的变化研究❋

徐 博， 宋平平， 吴 翠， 李卓俊， 巢志茂△

(1.中国中医科学院中药研究所， 北京 100700；2.国家中药材产业技术体系贮藏与包装岗位， 北京 100700)

中药款冬花为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，性辛、温，味微苦，归肺经，具有润肺下气、止咳化痰的功效，常用于治疗新久咳嗽、喘咳痰多等症[1]。与紫菀组成药对治疗咳嗽气喘、肺纤维化[2-4]，与其他中药组成咳喘宁胶囊提高机体抗氧化损伤的能力[5]；与射干等组成射干麻黄汤治疗儿童哮喘发作[6]，在秋梨膏、百花丸中也有款冬花[7]。目前，在款冬花中已发现的成分有黄酮类、倍半萜类、三萜类、生物碱类、甾醇类及挥发油等[8，9]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗血小板活化因子等活性[10，11]。款冬花应用历史悠久，分布广泛，主产区有河北晋州、山西长治[12]、陕西铜仁等地，以河北产款冬花质量最佳[13]。

药材中夹杂活虫或虫卵，在适宜的温湿度下，极易发生虫蛀现象[14，15]。款冬花是容易遭受虫害的中药材之一，通常发生在每年的5～10月份[16]。一旦遭受虫蛀，轻者表面出现虫洞，严重者变为粉末，并出现大量的害虫排泄物、残体及药末粉渣等。虫蛀后款冬酮的含量是否发生变化，虫蛀对款冬花其他化学成分的影响，如何鉴定款冬花是否虫蛀等，目前均未见报道。

近年来，1H NMR在中药质量分析领域有了广泛的应用[17，18]，与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(gas chromatography，GC)等相比，不需要复杂的前期色谱分离或衍生化，将之与多元统计相结合已逐渐用于中药材的真伪、产地、品种鉴别等研究[19]。本研究将1H NMR与多元统计相结合，对款冬花虫蛀后的化学成分变化进行了研究和讨论，为鉴定虫蛀款冬花建立了判别方法，并为研究虫蛀对中药材质量的影响提供了思路。

1 材料

AVANCE Ⅱ 400 MHz型核磁共振仪(德国布鲁克公司)，DFT-50A型手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，Ohaus CP224C型电子天平(奥豪斯(上海)仪器有限公司)，KQ-100E型超声波清洗器(100 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)，DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，分析级甲醇(北京化工厂)，D2O、CD3OD(SIGMA)，CD3OD含0.03%三甲基硅基(trimethylsilyl，TMS)。

款冬花由陕西榆林清阳中药材种植基地李永亮提供。部分款冬花样品经烟草甲虫蛀蚀后，出现了明显的虫蛀现象。中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定样品为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，蛀虫为鞘翅目烟草甲虫Lasiodermaserricorne(Fabricius)。

2 方法

2.1 样品制备

本实验的研究对象分为三种：第一种是质量合格、未被虫蛀的款冬花，粉碎过5号筛，称为未虫蛀款冬花；第二种是被烟草甲虫蛀蚀后的款冬花，粉碎过5号筛，称为虫蛀款冬花；第三种是款冬花被烟草甲虫蛀蚀后剔除蛀虫，过5号筛获得的烟草甲虫排泄物，称为排泄物。

分别精密称取样品粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇密塞，称定重量，超声30 min(100 W，40 kHz)，静置，冷却至室温，补足失重，摇匀过滤，50 ℃减压浓缩得提取物。提取物以D2O氘代后加入1.0 mL CD3OD，超声溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，取0.8 mL续滤液置于核磁管中以供测试。以上样品分别平行制备3份。

2.2 1H NMR测定

将2.1项下制得的样品溶液置于核磁共振波谱仪中进行1H NMR图谱采集。采集频率400 MHz，傅里叶变换0.122 Hz，脉冲序列zg30，脉冲间隔1.00 s，温度294.7 K，采样时间域66 k，采样时间4.09 s，扫描次数16次，谱宽8012 Hz。TMS为内标，CD3OD锁场。

2.3 1H NMR图谱处理及数据分析

将2.2项下采集的数据导入MestReNova软件(Version 9.0.1，Mestrelab Research SL，西班牙)中，相位自动修正、基线调整，以内标物TMS为基准校正化学位移。对δ8.00～0.00区间以每0.04 ppm作为积分单元进行分段积分，积分中除去CD3OD溶剂峰δ3.31～3.35及水峰δ4.70～5.10。分别将各段的积分面积基于峰面积进行归一化处理，从而得到化学位移积分段与积分值对应的数据矩阵。将数据矩阵导入SIMCA-p 13.0软件(Umetrics，Sweden)中进行PCA、PLS-DA及OPLS-DA分析。结合VIP值，筛选差异显著的化学成分，采用GraphPad Prism 7.00软件进行t检验(P<0.05)。

2.4 化合物指认

根据款冬花中化学成分结构式及相应的化学位移、裂分情况和峰面积，对化学成分进行指认归属。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 取同一份虫蛀款冬花的样品溶液，按照2.2项下的测试条件连续测定6次，按照2.3项下的方法处理图谱，将数据导入Excel中计算相关系数，考察仪器的精密度。

2.5.2 重复性考察 按照2.1项下的制备方法平行制备虫蛀款冬花样品溶液6份，按照2.2项下的条件测定，按照2.3项下的方法处理图谱，将数据导入Excel中计算相关系数，考察其重复性。

2.5.3 稳定性考察 取同一份虫蛀款冬花的样品溶液，按照2.2项下的测试条件测定其在48 h内的稳定性，按照2.3项下的方法处理图谱，将数据导入Excel中计算相关系数，考察样品在48 h内的稳定性。

3 结果

3.1 方法学考察

在精密度考察中，6组数据的相关系数均在0.99以上，表明仪器的精密度良好；重复性考察中，6组数据的相关系数均在0.99以上，表明重复性较好；稳定性考察中，48 h内各组数据的相关系数均在0.99以上，表明样品溶液在48 h内稳定。

3.2 1H NMR图谱及信号归属

为探究款冬花虫蛀后化学成分的变化，将款冬花虫蛀前后的1H NMR图谱进行对比。未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花及排泄物的1H NMR图谱见图1。从图中可以看出，三种样品具有相似的1H NMR轮廓，且由于各提取物中化学成分比较复杂，图谱中化学信号重叠现象严重，仅靠肉眼观察获得的信息有限，并不能全面、客观、准确地区别三者之间化学成分的差异。而多元统计分析可从大量、复杂、多维的数据中提取有效信息，建立数学模型对样品进行分类，并分析对分类具有较大贡献的差异成分，从而实现差异性化学成分的筛选和分析评价[20]，故本研究采用多元统计进行进一步分析。

有研究从款冬花的生品和蜜炙品中报道了40个化合物[21]]，并进行了生品与蜜炙品[22]、不同性状[23]、不同来源[24]、茎和叶化学成分的比较等[25]。基于1H NMR图谱，本研究根据化学位移、峰裂分及峰面积，共指认33个化合物(详见表1)。根据化合物的结构式及其质子的化学位移，1H NMR图谱大致分为三部分即氨基酸及有机酸区(δ3.10～0.70)，主要包括异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、柠檬酸、琥珀酸等；碳水化合物区(δ5.50～3.10)，主要包括蔗糖、葡萄糖等；低场区(δ8.00～5.50)，主要包括芦丁、绿原酸、异绿原酸、腺嘌呤等。

表1 款冬花样品指认的化学成分

3.3 PCA

PCA是一种常用的多变量降维分析方法，可在尽量保留原始数据的基础上，把高维数空间的数据信息映射到低维数的少数主要成分(principal components，PCs)上。这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，从而实现数据的简化，便于数据特征的分析。将2.3项下得到的数据矩阵导入SIMCA-p软件中进行PCA分析(结果见图2)。未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花和排泄物分别集中在不同区域，各自聚为一类，其界限清晰，无互相重叠，表明PCA可将虫蛀款冬花与未虫蛀款冬花进行有效判别。在PCA分析中，R2X表示该模型中主成分的累积贡献率，Q2表示预测模型中主成分的累积贡献率，R2X与Q2的值越接近1.0，模型构建越成功。结果显示，前4个主成分的贡献率分别为PC1：51.4%，PC2：37.5%，PC3∶5.0%和PC4∶3.4%，R2X为97.3%，Q2为88.3%，说明模型构建成功。

图2 未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花及排泄物的PCA得分图

由于PCA是一种无监督的模式分析方法，主要考察样品在无监督、自然情况下是否可以有效分类，仅能把具有相似特征的数据归为一类，但不能忽略组内误差、消除与研究目的无关的随机误差。为进一步探究款冬花虫蛀后化学成分的变化，本研究进一步采用有监督的方法PLS-DA及OPLS-DA进行分析。

3.4 偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)

PLS-DA先将待分析样品按原始属性类别分组，再建立模型进行统计分析，以利于最大化提取不同组别间波谱图的差异，从而推导出存在差异的化学成分。将2.3项下得到的数据矩阵导入SIMCA-p软件中(结果见图3)。未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花和排泄物集中在不同的区域各自聚为一类，3种样品之间界限清晰，无互相重叠。在PLS-DA中，常采用R2Y和Q2评价模型的质量，R2Y主要反映模型的拟合程度，Q2则主要反映该模型的预测程度。R2Y及Q2值越接近1.0，说明模型构建越成功。前3个主要成分的R2Y为99.5%，Q2为96.3%，说明模型构建成功有效，这与3.3中PCA的分析结果一致，表明未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花和排泄物之间化学成分存在明显差异。

图3 未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花与排泄物的PLS-DA得分图

为进一步寻找出存在差异的化学成分，通过VIP>1.0及P<0.05进行筛选，并结合t检验进行验证。结果表明，排泄物中异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、醋酸、1-O-乙基-β-D-葡萄糖苷、鼠李糖的含量升高明显；而琥珀酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、胆碱、肌酸、卵磷脂、乙醇胺、绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、3，4-O-二咖啡酰奎宁酸、芦丁、甲酸、腺嘌呤、对羟苯甲酸、富马酸、马来酸、β-谷甾醇的含量下降显著。

3.5 正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal patial lenst squares discriminate analysis,OPLS-DA)

OPLS-DA是在PLS-DA的基础上结合正交信号，去除与Y矩阵无关的X矩阵变化，使不同组别的分类差别达到最大，从而更有利于寻找不同组之间存在差异的化学成分。从OPLS-DA得分图(见图4)中可以看出，未虫蛀款冬花与虫蛀款冬花均各自聚为一类且界限明显。为验证模型的可靠性，本研究采用200次置换检验(permutation test)，即将每个样本标记随机打乱，再进行建模和预测。R2和Q2在Y轴上的截距分别为0.169和-0.664。R2的截距几乎接近于0，Q2的截距小于0.05，说明模型出现过拟合的可能性较小，模型可靠。

图4 未虫蛀款冬花与虫蛀款冬花的OPLS-DA主成分得分图

图5 OPLS-DA置换检验结果(n=200)

为进一步寻找出存在差异的化学成分，通过VIP>1.0及P<0.05进行筛选，并结合t检验进行验证。结果表明，与未虫蛀款冬花中各化学成分的含量相比，虫蛀款冬花中款冬酮的含量下降明显。

4 讨论

众所周知，虫蛀对中药材的品质危害极大。虫蛀后的中药材普遍存在着有效成分含量下降的现象，但如何进行药材虫蛀前后的鉴别尚未见报道，对此本研究采用易遭受虫蛀的款冬花药材进行了初次尝试。目前，1H NMR技术结合多元统计分析已在中药材的品种比较[26]、真伪鉴别[27]、不同炮制品质量的评价[28，29]等方面有了一定的应用，采用1H NMR技术用于虫蛀后研究，而PCA、PLS-DA及OPLS-DA可对未虫蛀款冬花、虫蛀款冬花进行有效区分并推而广之。此外，通过1H NMR特征图谱峰共指认出33个化合物，结合VIP值对虫蛀前后含量变化显著的成分进行筛选。本研究为研究更多的中药材虫蛀变质现象提供了新的思路与方法。

在烟草甲虫蛀蚀款冬花后的排泄物中，绿原酸、异绿原酸等款冬花的次生代谢产物含量下降，说明烟草甲虫对这些次生代谢产物进行了吸收和代谢。在其排泄物中异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸的含量明显高于未虫蛀款冬花和虫蛀款冬花中的含量，推测这些成分是烟草甲虫蛀蚀款冬花后通过代谢产生了更多的氨基酸。由于中药材的有效物质大多为次生代谢产物，其种类、含量及各成分之间的相对比例是决定中药有效性和质量优劣的关键[30]，被烟草甲虫蛀蚀后，款冬花的次生代谢产物含量及相对比例均受到影响，推测其品质和临床疗效也必然会受到影响。款冬酮作为款冬花的主要有效成分之一，具有明显的镇咳平喘作用[31]，是款冬花唯一含量测定的有效成分[1]，也可作为是否虫蛀的标志性指标。异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸含量的升高，提示在进行中成药或提取物的提取和制备时，可通过制定限量值对款冬花的投料进行控制。