基于中医脾虚量表的结直肠癌患者临床特征、肠道菌群及免疫功能相关性研究❋

闫蕴孜， 孙凌云， 闫韶花， 吴 娜， 宁春晖， 杨宇飞△

(1.北京中医药大学西苑临床医学院， 北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

结直肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一。据最新数据显示，我国结直肠癌发病率和死亡率分别居全部恶性肿瘤的第4位和第5位，且发病率和死亡率呈逐年上升趋势[1]。中医认为结直肠癌病位在肠，病本在脾。“脾主运化”是脾最主要的生理功能，是指脾将水谷精微消化吸收并传输至全身的功能，其包括营养物质的消化吸收和物质转化为能量的过程。有研究表明，能量代谢在肿瘤发病过程中扮演着重要角色[2]。因此，“脾失健运”可能通过能量代谢参与结直肠癌的发生发展[3]。

近年来有相关研究表明，肠道微生物参与结直肠癌的发生发展，进一步研究发现脾虚与肠道微生物之间存在着密切关系[4，5]。此外，中医认为“脾为之卫”“四季脾旺不受邪”，素体脾气虚弱易招致外邪侵袭，这也说明脾对邪气具有抵御力。所以，脾主运化水谷、抵御外邪与肠道微生物的代谢以及机体免疫功能调节具有相似之处。由此可见，脾虚、肠道菌群与宿主免疫之间可能存在一定的相关性，平衡稳定的肠道菌群及免疫功能可能是维持“脾主运化”的一个重要条件。基于上述理论基础及团队前期研究，采用团队自制中医脾虚量表(traditional chinese medicine spleen deficiency scale, TCM-SDS)[6]，计划从肠道菌群及细胞免疫角度进一步探索结直肠癌患者脾气虚证的生物学特征，为进一步研究脾气虚证的生物学机制提供客观科学依据。

1 资料与方法

1.1 病例来源

纳入2018年3月至2020年12月期间在中国中医科学院西苑医院、北京大学肿瘤医院门诊及病房就诊的96例结直肠癌患者。

1.2 纳入标准

有明确病理学诊断的结直肠癌患者；具备明确的临床或病理学TNM(tumor node metastasis，TNM)分期；年龄18～80岁，性别不限；签署知情同意书且依从性良好的患者。

1.3 排除标准

既往合并其他原发恶性肿瘤史；正处于化疗期、放疗期、靶向治疗及免疫治疗期的患者；合并严重心血管系统并发症、脑血管系统并发症、活动性肝炎、严重肝肾功能异常; 任何不稳定情况或可能危害患者安全及其研究依从性的情况，如精神分裂症等严重精神疾病患者; 在入组治疗开始特定期间内接受下列任何治疗的受试者: (1)在2周内曾接受抗生素口服或静脉输液治疗;(2)正在接受肠道菌群调节剂(如培菲康、乳酸菌素片)。

1.4 诊断标准

1.4.1 结直肠癌诊断标准 参照中华人民共和国卫生部医政司《中国常见恶性肿瘤诊治规范》[7]结直肠癌诊断标准。

1.4.2 TNM分期标准 参照美国癌症联合委员会(AJCC)第八版分期标准[8]。

1.5 相关信息采集

1.5.1 中医脾虚量表 本研究采用中医脾虚量表(TCM-SDS)进行分析，共5个条目。问卷采用5分制选项，分别为 “没有=1、偶尔=2、有时=3、经常=4、总是=5”以评判患者脾气虚的程度。研究分析过程中将对该量表分别计算总分，并且转化为最高分为10分的分值以便进行分析与比较，同时将计算该量表平均值，将入组患者划分为“脾气虚”“非脾气虚”组进行二分类变量的检验(详见表1)。

表1 中医脾虚量表

1.5.2 粪便样本采集及肠道菌群检测 研究所用的粪便采集试管套装均由美吉生物医药科技有限公司提供。受试者需采集排便后10 min内的粪便，且避免尿液污染。在取样后(常温保存)14 d内寄送至研究者手中。研究者对粪便样本进行编号标注后统一寄送至美吉生物医药科技有限公司。粪便肠道菌群样本均由中国上海美吉生物公司采用16SrRNA分析方法进行检测。

1.5.3 血液标本采集 采集受试者入组当天静脉血2 mL装入EDTA-K2抗凝管(紫色试管帽)，由中国中医科学院西苑医院血液实验室、北京大学肿瘤医院血液实验室(流式细胞仪型号：Navios Beckman Coulter)分别对受试者样本进行检测，抗体选用CD3、CD25，HLA-DR，采用流式细胞术对T(CD3+CD4-CD8-/CD3+CD4+CD8+/CD3+CD4+CD8-/CD3+CD4-CD8+)、B 淋巴细胞亚群、NK细胞进行检测。

1.6 统计学方法

1.6.2 粪便菌群样本分析 将统计分析数据上传至美吉生物云平台(http://cloud.majorbio.com)，利用云平台上的分析软件进行肠道菌群样本分析。基于 OTU 聚类分析结果，可以进行多样性指数分析，2组间多样性指数差异采用 Studentt检验或 Wilcoxon 秩和检验;基于分类学信息可以进行群落结果的统计，对于多组间差异性检验采用 Kruskal-Wallis 秩和检验 (Kruskal-Wallis H test)，2组间差异性检验采用 Student t 检验。

2 结果

2.1 人口学信息

本研究共纳入96例结直肠癌患者，其中男性64例(66.70%)，女性32例(33.30%)(详见表2)。

表2 受试者人口学信息特征

2.2 基于TCM-SDS量表的结直肠癌患者临床特征分析

原发肿瘤部位、手术情况、病理类型、分化程度、是否造瘘、基因状态、微卫星状态各组间在脾气虚程度得分比较差异无统计学意义(P>0.05)(详见表3)。

表3 脾气虚程度与结直肠癌患者临床特征差异性分析

2.2.1 基于TCM-SDS量表脾气虚分组的结直肠癌患者临床特征分析 96例患者TCM-SDS量表平均分值为(3.92±1.71)，将TCM-SDS量表>3.9的患者划分为“脾气虚组”，将<=3.9分患者划分为“非脾气虚组”，对2组临床特征及基本信息进行差异性比较。统计分析结果显示，结直肠癌患者脾气虚组与非脾气虚组在原发肿瘤部位、手术情况、病理类型、分化程度、基因状态以及微卫星状态方面比较差异无统计学意义(P>0.05)(详见表4)。

表4 脾气虚与非脾气虚结直肠癌患者临床特征差异性分析

2.2.2 基于TCM-SDS量表脾气虚分组与TB淋巴细胞亚群的差异性分析 统计分析结果显示，脾气虚组与非脾气虚组在淋巴细胞(Lymphocyte)、双阴性T细胞(double-negative T-cell,DNT)、辅助性T细胞(helper T cell，TH)、细胞毒T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,TC)、双阳性T细胞(double-positive T cell,DPT)、总T细胞(T-lymphocyte)、总B细胞(B lymphocyte)以及自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的比较中差异无统计学意义(P>0.05)；脾气虚组与非脾气虚组在NKT细胞绝对值比较差异有统计学意义(45.5,IQR 50.8 vs. 28 IQR 52, U=208，P=0.049)(详见表5图1)。

图1 脾气虚组与非脾气虚组NKT细胞分布差异(左：2组NKT细胞绝对值差异性比较分析；右：代表性NKT淋巴细胞流式圈门图)

表5 脾气虚组与非脾气虚组TB淋巴细胞亚群的差异性分析

2.3 结直肠癌脾气虚与非脾气虚患者肠道菌群分布差异

纳入分析96例患者中共83例完成了粪便菌群样本采集，共包含1336600条DNA序列。利用美吉生物云平台(http://cloud.majorbio.com)进行生物信息分析，OTU物种分析显示所有样本中共包含微生物物种门水平27种，纲水平53种，目水平137种，科水平259种，属水平615种，种水平1260,OTU水平3203种。Rank-Abundance曲线提示，所有样本中种类较丰富(详见图2)。Pan/Core曲线分析提示曲线平滑，所查样本量充足(详见图3)。

图2 Rank-Abundance curves

图3 Pan/Core曲线

2.3.1 物种组成分析 在属(Genus)水平对脾气虚组与非脾气虚组进行物种组成Venn图分析，结果显示2组共有2066个共同菌种，脾气虚组具有特殊菌种720个，非脾气虚组具有特殊菌种1048个(详见图4)。

图4 脾气虚与非脾气虚组肠道菌群物种分布Venn图

群落Bar图组成分析结果显示，结直肠癌脾气虚组、非脾气虚组患者肠道菌群样本中优势物种在属(Genus)水平的组成相同，包含有拟杆菌属(Bacteroids)、普雷沃菌属(Prevotella)、志贺菌属(Escherichia-Shigella)以及粪球杆菌属(Feacalibacterium)，但是其相对丰度不同(详见图5)。TNM分期群落Pie图显示，与脾气虚组患者肠道菌群比较，非脾气虚组患者肠道群落中的拟杆菌属占比增加为29.79%；而普雷沃菌属、志贺菌属以及粪球杆菌属占比减少，分别为3.72%、4.83%、3.86%(详见图6)。

图6 脾气虚组与非气虚组肠道菌群样本优势物种分布Pie图

2.3.2 物种组成差异分析 采用Student’s-t检验对结直肠癌患者脾气虚组、非脾气虚组患者肠道菌群在属水平物种进行差异性分析，结果显示非脾气虚组中双歧杆菌属(Bifidobacterium)丰度显著低于脾气虚组，且差异有统计学意义(P<0.05)(详见图7)。

图7 脾气虚组与非气虚组肠道菌群物种差异分析

3 讨论

3.1 TB淋巴细胞亚群与结直肠癌脾气虚证的相关性探讨

研究结果中，脾气虚组与非脾气虚组在NKT细胞水平上差异有统计学意义。进一步分析发现，脾气虚组NKT细胞绝对值水平较非脾气虚组高。NKT细胞属于特殊的T细胞亚群，具有很强的抗肿瘤活性。NKT细胞可以被IL-2(Interleukin-2、IL-2)、IL-15(Interleukin-15，IL-15)和IFN-γ(interferon γ，IFN-γ)等细胞因子激活产生应答[9]，活化后的NKT细胞可以通过分泌穿孔素、颗粒酶或Fas/FasL途径杀伤某些肿瘤和病原体感染的靶细胞，也可通过分泌IL-4(Interleukin-4，IL-4)或IFN-γ参与体液免疫活细胞应答，增强机体抗感染和肿瘤的作用[10]；从中医方面来说，中医认为结直肠癌的发生发展多为“因虚致积”[11，12]，多因体内正气不足导致人体防御能力下降。由此可见，正气亏虚导致的免疫功能下降是恶性肿瘤发病的基础，所以NKT细胞绝对值的变化，可能是反映脾气虚变化的生物学指标。

3.2 肠道菌群对结直肠癌脾气虚证的生物学特征预测

从群落组成分析结果来看，非脾气虚组患者肠道群落中普雷沃菌属、志贺菌属以及粪球杆菌属占比减少。有相关研究表明，普雷沃菌属可以通过免疫炎症反应基因的表达影响结直肠癌的发展。志贺菌属、粪球菌属被证明与肠道感染以及促进结直肠肿瘤细胞增殖有关，大都是通过诱导肠上皮细胞内超氧化物的形成，导致结肠上皮细胞的损伤造成炎症感染[13，14]。结直肠癌脾气虚证患者常以腹泻、腹胀、肠鸣等症状为主，同时有大量实验研究表明，脾虚会影响肠道菌群物种丰富度及数量的变化[15-18]，说明在脾虚状态下机体代谢功能降低，其功能变化可能与肠道菌群组成及丰度变化有关。所以，通过这3种菌属的丰度变化可以判断，该菌属可能会成为中医治疗结直肠癌脾气虚的生物标志物。

脾气虚组肠道菌群中双歧杆菌属丰度较高，很多研究证明，益生菌对抑制肿瘤的发生或缓解治疗相关副作用是有益的。双歧杆菌常被用于围手术期预防腹泻、感染等术后并发症，也有研究报道，其可以用于提高癌症的治疗效率[19]。有研究报道，脾气虚会导致肠道菌群失调，益生菌数量减少，导致肠道内短链脂肪酸水平的下降[20]。而本研究所纳入的患者均经过一段时间的中药治疗以恢复手术导致的正气虚损，中药处方以健脾为主以恢复体内正气。据相关研究报道，以健脾为主的中药复方能够提高脾虚型小鼠肠道双歧杆菌及乳酸杆菌的丰度[21-23]，所以脾气虚组中双歧杆菌属丰度的增高可能与口服中药治疗相关，但其相关作用机制还需要进一步的研究。

本研究纳入患者处在不同临床分期和治疗阶段，所以脾气虚的严重程度存在一定的差异。且此研究仅对“脾气虚证”进行重点分析和探讨，而在临床实际中，患者的证型并不单一且无规范的统一诊断标准。在肠道菌群分析方面，本研究采用16SrRNA分析方法仅能够对患者肠道菌群多样性进行观察与分析，而对于菌群功能预测欠佳。此外，课题组前期研究基础发现，中药干预后CD4T细胞绝对值明显升高，并与放线菌中的双歧杆菌具有显著相关性，但此结果是否与机体脾虚状态有关仍需进一步研究。本研究纳入不同医院结直肠癌患者在TB淋巴细胞亚群的实验室检测环境及试剂可能存在一定差异，但属于可接受的系统误差。未来我们可以通过对不同分期、不同治疗阶段进行分层分析，以比较不同状态下脾气虚证的差异，并进一步分析其与肠道菌群的相关性。此外，我们还可以通过宏基因组学方法进一步分析，以更加深入了解结直肠癌脾气虚证与肠道菌群的相关机制。