活血散结方对PDGF干预下兔RPE细胞凋亡及caspase-3、P53表达的影响❋

刘晓清， 李建超， 谭涵宇， 彭 俊， 彭清华△， 吴权龙△

(1.湖南中医药大学， 长沙 410208；2.中医药防治眼病与视功能保护湖南省工程研究中心， 长沙 410208；3.西安市中医医院，西安 714000；4.湖南中医药大学第一附属医院， 长沙 410007)

增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是以细胞异常高增殖与低凋亡为病理特征的难治性致盲眼疾。正常情况下，兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞的增殖与凋亡始终保持动态平衡，而在视网膜裂孔形成、外伤和眼内炎症等病理情况下，这种平衡会遭到破坏。血视网膜屏障遭受损伤后RPE细胞暴露于外，在多种细胞因子激活下通过细胞信号级联反应及基因调节进入细胞周期开始过度增生，并伴有RPE细胞表型变化及胶质细胞等的增生，从而进一步导致视网膜下、视网膜前及玻璃体中形成增殖膜。最终，因增殖膜的收缩而发生牵拉性视网膜脱离，造成视力的丧失[1]。

课题组前期研究成功建立血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF,10 μg·L-1)干预下RPE细胞增殖模型，发现10%和20%活血散结方含药血浆能抑制兔RPE细胞的增殖与迁移[2，3]。为继续深入研究活血散结方抑制PVR的药理作用机制，本实验采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对该方君药三七、丹参相应主要成分三七皂苷R1、丹参酮进行含量测定，为该方的药效研究提供了相关质量标准[4]。并观察活血散结方含药血浆对PDGF干预下兔RPE细胞的凋亡、caspase-3及P53蛋白表达的影响，从细胞生物学角度探讨活血散结方治疗PVR与细胞凋亡相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康成年青紫蓝兔8只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg，由上海市松江区车墩实验动物良种场提供，实验动物许可证号SXCK(沪)2012-0008，用于取原代细胞。成年健康家兔10只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，实验动物许可证号SCXK(湘)2015-0004，用于制备活血散结方含药血浆。动物饲养于湖南中医药大学兔豚鼠实验中心，饲养条件为室温18～26 ℃，湿度55%。

1.2 药物

活血散结方组成：三七(批号2001060152)、丹参(批号HY20081202)、海藻(批号2002202)、昆布(批号2008104)、鳖甲(批号HH20081905)、地龙(2020062403)，均购于湖南中医药大学第一附属医院，所购药材为同一批次，采用水煎法，分煎2次后混合药液浓缩至1.025 g/mL生药浓度，4 ℃下保存。

1.3 试剂与仪器

DMEM/F12(货号：SH30023,美国Hyclone公司)；胎牛血清(货号：11011-8611，杭州四季青)；PDGF-BB(货号：07-1437，美国sigma公司)；PDGF抑制剂AG1296(货号：S8024，美国Selleck公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(货号：APOAF-20TST，美国sigma公司)；caspase-3小鼠单克隆抗体(货号：ab44976，1∶1000，Abcam公司)；p53小鼠单克隆抗体(货号：ab244024，1∶1000，Abcam公司)；GAPDH小鼠单克隆抗体(货号：10494-1-AP，1∶1000，Proteintech)；HRP羊抗鼠二抗(货号：SA00001-1，1∶3000，Proteintech)；三七皂苷R1对照品、丹参酮对照品(货号：A0273、YM140B，中国药品生物制品检定所)等。

CO2细胞培养箱(Thermo公司，型号HERACELL)；生物安全柜(Thermo公司，型号Scientific 1300)；倒置显微镜(Motic公司，型号AE31)；低速离心机(Thermo公司，型号Fresco 17)；流式细胞仪(Beckman Coulter公司，型号BV510)等。

1.4 活血散结方含药血浆制备与收集

成年健康家兔10只按随机数字表法分为药物组与正常组各5只。根据人与家兔体表面积换算方法计算(人以60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准)活血散结方家兔临床等效剂量为每日5.064 g/kg。取4倍家兔临床等效剂量即每日20.5 g·kg-1，水煎制成含1.025 g·mL-1生药的药液，给予药物组家兔以20 mL·kg-1灌胃给药，每日2次，共给药5 d。空白对照组用蒸馏水进行灌胃。第5天灌胃结束2 h后，麻醉下腹主动脉取血取上清，0.22 μm过滤器过滤后分装，-70 ℃保存。

1.5 HPLC检测活血散结方含药血浆浓度

血浆样本：兔正常组血浆分为a、b 2组，兔药物组含药血浆分为A、B、C、D、E 5组。采用HPLC法检测活血散结方君药三七、丹参相应主要成分三七皂苷R1、丹参酮[4]含量。条件为乙腈-0.4%磷酸混合液(13:87)，0.45um滤膜抽滤，等梯度洗脱C18柱(Diamonsil，5μm，250×4.6 mm)，流速1.0 mL·min-1,柱温25 ℃,检测波长327 nm。

1.6 兔RPE细胞的培养

8只成年健康无眼疾青紫蓝兔，空气栓塞法处死，无菌条件下获取眼球分离视网膜，胰酶消化法获取RPE细胞，将其调整为(4～5)×104个·mL-1密度，接种于25 mL培养瓶，在含5%CO2、湿度为90%的37 ℃培养箱中培养，细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。

1.7 RPE细胞凋亡检测

实验分空白对照组(DMEM)、正常血浆组、PDGF(10 μg·L-1)组、PDGF(10 μg·L-1)+AG1296(10 μmol·L-1，PDGF抑制剂)组、PDGF(10 μg·L-1)+10%含药血浆组、PDGF(10 μg·L-1)+20%含药血浆组。采用双标法流式细胞仪检测，胰酶消化后收集对数生长期的RPE细胞，将细胞悬液密度调至5×105个·mL-1，取96孔板，根据分组每个孔板加入相应细胞悬液1 mL，每孔再添加2 mL完全培养基，混匀后置于5% CO2、 37 ℃培养箱中培养，每孔内细胞融合率达70%～80%后按分组加入相应的干预试剂及药物，48 h后收样进行流式检测。

1.8 Western blot检测 caspase-3及P53表达

分组同上，上述同操作48 h后收样进行western blot检测。将样本加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中，4 ℃下充分裂解，刮入1.5 mLEP管，95 ℃加热10 min，离心后取上清，蛋白定量后贮存于-80 ℃。取等量蛋白进行电泳、转膜、封闭。膜封闭后加入一抗、二抗。ECL化学发光法检测，IPP6.0软件对图像进行灰度值分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 线性关系及含量

分别精密吸取对照品溶液三七皂苷R1(0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mL)和丹参酮(0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL)，流动相定容至10 mL，得到系列浓度的对照品混合溶液，分别进样3针，每次进样20μL，记录色谱图(见图1、2)。以对照品浓度为横坐标(X)，对照品与内标的峰面积比为纵坐标(Y)进行线性回归(见表1)。HPLC测定结果显示，含药血浆各组的三七皂苷R1含量及丹参酮含量均在线性范围之内，含药浓度较理想。各组兔(不同兔含药血浆标本)的三七皂苷R1含量及丹参酮含量稳定，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表1 活血散结方中君药主要成分线性考察结果

图1 三七皂苷R1对照品HPLC-UV色谱图

图2 丹参酮对照品HPLC-UV色谱图

表2 HPLC测定血浆样本中三七皂苷R1及丹参酮含量结果

2.2 活血散结方含药血浆对PDGF干预下RPE细胞凋亡的影响

各组加入相应的干预因素后，流式细胞仪进行检测。PDGF具有抑制RPE细胞凋亡的作用，PDGF组与正常血浆组比较，凋亡率明显降低(P<0.01)；AG1296为PDGF的抑制剂，有促进RPE细胞凋亡的作用，PDGF+AG1296组RPE细胞凋亡率高于PDGF组，差异有统计学意义(P<0.01)；10%和20%的含药血浆均有提高RPE细胞凋亡率的作用，PDGF+10%含药血浆组、PDGF+20%含药血浆组的RPE细胞凋亡率均高于PDGF组，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明2种浓度活血散结中药复方含药血浆均能促进RPE细胞凋亡。AG1296、10%和20%浓度的含药血浆促进RPE细胞凋亡作用，3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3图3)。

表3 活血散结含药血浆对PDGF干预下RPE细胞凋亡的影响

图3 各组细胞凋亡图谱

2.3 P53、Caspase-3蛋白表达

PDGF组中RPE细胞P53、Caspase-3蛋白相对表达量均低于正常血浆组(P<0.01)，表明PDGF有抑制RPE细胞P53、Caspase-3蛋白表达作用；PDGF+AG1296组中RPE细胞P53、Caspase-3蛋白相对表达量均高于PDGF组(P<0.01)，表明PDGF抑制剂AG1296有促进RPE细胞P53、Caspase-3蛋白表达的作用；PDGF+10%含药血浆组和PDGF+20%含药血浆组RPE细胞P53、Caspase-3蛋白相对表达量均高于PDGF组(P<0.01)，表明10%与20%浓度的含药血浆均有促进RPE细胞P53、Caspase-3蛋白表达的作用，且AG1296、10%和20%浓度的含药血浆3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表4图4)。

表4 活血散结含药血浆对PDGF干预下RPE细胞P53、Caspase-3蛋白表达的影响

注：A.空白对照组；B.正常血浆组；C. PDGF组；D.PDGF+AG1296组；E.PDGF+10%含药血浆组；F.PDGF+20%含药血浆组图4 Western blot检测凋亡相关蛋白表达比较

3 讨论

国内外研究证明，PVR发病机制是以细胞介导为主的损伤过度修复病理过程[5]，RPE细胞是PVR增殖膜中主要成分之一[6]，其迁移、增殖、凋亡等是促进PVR发生发展的关键，同时受细胞因子激活的蛋白质细胞信号通路及相关基因表达的调控。临床研究发现，PVR患者的玻璃体以及增殖膜上PDGF大量表达[7]，Lei[8]在研究中发现，PDGF受体α在PVR发生发展中的作用比PDGF受体β更为显著，并证实PDGF的表达决定着细胞移行，继之伴随受体活化可促进PVR的发展。Ando等[9]在实验中发现，G0、G1期的RPE细胞在PDGF的作用下容易进入分裂增生周期。在眼部，PDGF可促进RPE细胞表型变化和人RPE细胞α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达，而a-SMA的表达与PVR的病变程度密切相关[10，11]。特别是RPE细胞转化为肌纤维样细胞表达a-SMA后，增殖膜的收缩促成了PVR的最终转归—牵拉性视网膜脱离的发生，因此PDGF是PVR发展过程的关键因子。

在细胞凋亡中，p53与Caspase是凋亡信号传导通路中的重要成员。Caspase-3是细胞凋亡途径最后的共同通道[12]，也是细胞凋亡的执行者。郭丽莉等[1]研究表明，整合素连接激酶在RPE细胞中被敲减后，随着caspase-3的表达升高，RPE细胞凋亡也随之增加。而正常野生型p53基因编码后翻译合成的p53蛋白，在细胞周期DNA合成前期即S期能发挥分子警察的重要功能，一旦发现DNA受损，随即阻碍细胞周期运行并修复，如DNA修复失败，p53则启动细胞凋亡程序促进细胞死亡。Esser等[13]通过临床与实验研究发现，在PVR增殖膜中，RPE细胞不仅存在细胞增殖，还明显存在凋亡的现象。管红兵等[14]在动物实验中也发现，PVR病理过程中出现包含RPE细胞等多种细胞的凋亡，认为细胞凋亡也是PVR发生发展的重要调控机制。

PVR属于中医“暴盲” 病范畴，活血散结方由彭清华教授根据眼科活血利水法创立，转为治疗PVR而设，具有活血化瘀、软坚散结之功[15-17]。组方中药物多具有抗凝、抗纤维化、抑制细胞异常增殖及促进肿瘤细胞凋亡的作用。相关药理学研究表明，三七中含有多种化学成分，其中三七素能降低毛细血管的通透性而增进凝血功能；三七人参三醇型皂苷能抑制血小板聚集，降低血液黏度；三七中最主要的化学成分三七皂苷能对肝纤维化起到预防和阻断作用[[18,19]。丹参具有改善多脏器的缺血再灌注损伤、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制胶原纤维产生和促进纤维蛋白降解、抑制细胞增殖等多方面作用[20]。本实验采用HPLC法测定制备的多组含药血浆标本，结果表明各含药血浆组三七皂苷R1及丹参酮含量均在线性范围内，含药浓度较理想，故认为本次制备的含药血浆成功。

从本次实验结果得出PDGF能抑制兔RPE细胞凋亡，亦能抑制与凋亡相关的p53与Caspases-3蛋白的表达；推测PDGF可以通过抑制细胞凋亡，从而对RPE细胞过度增生分裂有促进作用，进而推动PVR的发展。结果还显示，10%和20%浓度的含药血浆均能提高PDGF干预下兔RPE细胞与凋亡相关的p53与Caspases-3蛋白表达，且存在一定的量效关系，与AG1296作用相当。表明活血散结方能通过提高caspase-3及P53蛋白的表达促进RPE细胞凋亡。

综上，活血散结方含药血浆作用于PDGF干预下RPE细胞增殖模型，可促进RPE细胞caspase-3及P53蛋白表达，从而增加细胞凋亡，进而达到阻止PVR进展的作用。前期研究亦证明，其能抑制RPE细胞增殖[2]，因此活血散结中药复方可能通过双重调节机制阻止PVR发生发展，有望成为临床治疗PVR的新药。