低温水提松茸免疫活性因子的试验研究

杜汉廷，葛 麒，林松毅，陈 冬

（大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，大连 116034）

0 引 言

松茸（Singer），学名松口蘑，属担子菌门担子菌纲伞菌目口蘑科口蘑属，主要分布于亚欧和北美地区，在中国的吉林省、云南省以及川藏地区等都有分布。松茸是一种珍贵的野生药食用菌，因其味道鲜美、基础营养成分全面且其子实体中含有松茸双链多糖、松茸醇及松茸多肽等珍贵生物活性成分而备受推崇。松茸子实体中蛋白质含量近20%，这些蛋白质为人体提供营养物质的同时，也具备抗炎、抗癌、抗氧化、增强免疫调节等多种生物活性。近些年，松茸已成为全球化的天然滋补类真菌之一，其所含的蛋白质资源作为一种功能性食品组分值得进一步研究。

免疫调节是机体免疫系统应对内外部有害因素所进行的一个复杂的生物过程，在各种人类疾病中发挥重要作用。巨噬细胞是构成机体免疫系统中免疫细胞的重要成员之一，其被激活后通过分泌NO、HO、TNF-、IL-6等免疫活性分子直接杀伤病原微生物，进行免疫调节。目前，关于食用菌免疫活性因子已开展了一些研究。有研究表明，云芝中的糖肽具有显著的免疫调节活性，能够促进大鼠IFN-、IL-1、IL-2的产生，增强免疫调节能力；Ditamo等研究发现双孢菇中凝集素具有减少先天性和适应性反应的体内免疫调节作用。此外，Yu等研究发现灵芝多糖显著刺激小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性，提高NO、TNF-和IL-1的产生，激活MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信号通路，恢复Cy诱导小鼠的免疫抑制。Zhao等研究表明金针菇粗多糖可调节ICR小鼠肠道微生物群，提高血清免疫球蛋白和细胞因子的水平，具有潜在的抑制肥胖和免疫调节能力。Wu等通过体内免疫调节试验表明，猴头菇多糖能够显著提高免疫器官指数、脾细胞增殖能力、NK细胞活性和巨噬细胞吞噬作用，对环磷酰胺诱导的小鼠免疫抑制具有保护作用。然而，关于松茸源免疫活性因子的研究鲜有报道，尤其是蛋白免疫活性因子研究相对缺乏。

水浸提法是一种传统的提取方法，在食用菌活性物质提取中应用广泛，此法相较于醇提法、微波或超声辅助提取等提取方法，具有适用范围广，安全系数高，操作简便等优点，更加适用于工业化生产需求。一方面，低温提取更有利于完整保持提取物中的活性成分；另一方面，国内外学者研究多集中于中高温（>40 ℃）水浸提得到的松茸提取物。因此，关于松茸低温水浸提物及其免疫活性的研究值得进一步的探究。

本研究采用响应面法（Response Surface Methodology，RSM），分别以松茸蛋白得率和小鼠巨噬细胞NO释放量为考察对象，优化低温（≤30 ℃）水平下松茸水提免疫活性因子（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor，TMWEIF）的提取工艺。通过氨基酸分析和光谱学分析，初步解析TMWEIF的结构及物质组成，探讨TMWEIF的结构与功能活性的潜在联系。本研究旨在优化出综合性能较好的松茸低温水提工艺参数，并对提取物进行结构组成的初步解析，为松茸源免疫活性因子的分离纯化、免疫调节的潜在机制提供研究基础，为松茸的蛋白质资源开发利用及其保健食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山野生松茸冻干片，吉林省延吉市顺鑫松茸贸易有限公司；小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞，中科院生物化学与细胞生物学研究所。

牛血清白蛋白标准品（Bovine Serum Albumin，BSA）、噻唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT），北京索莱宝科技有限公司；DMEM培养基，美国Hyclone公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），美国Sigma公司；NO检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Infinite M 200多功能酶标仪，瑞士Tecan公司；L-8800型氨基酸分析仪，日本日立有限公司；IR Prestige-21傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；J-1500圆二色光谱仪，日本Jasco公司。

1.3 方法

取适量冻干松茸片，用高速粉碎机打碎成粉，过孔径0.25 mm筛网，密封置于干燥处备用。

准确称量10 g松茸干粉，按设定提取条件开展试验。提取结束后，将混合物在4 ℃、6 760×的条件下离心，上清液冻干保存至-80 ℃备用。

采用双缩脲法测定样品中蛋白含量，并做适当改进。以BSA（10 mg/mL）为标准品，按照1∶4比例添加双缩脲试剂，混匀反应15 min后，于540 nm处测定吸光度，以BSA质量浓度为横坐标（mg/L），吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。TMWEIF蛋白含量测定标准曲线回归方程：=0.044 8-0.003 8，=0.999 4。蛋白得率的计算公式

式中为由BSA标准曲线求得的蛋白浓度，mg/mL；为水提液总体积，mL；为松茸干粉质量，g。

选定液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g）、提取时间（30、60、90、120、150 min）、提取温度（10、15、20、25和30 ℃）3个因素进行单因素试验，考察各单因素水平对松茸水提液中蛋白得率的影响，以确定相关工艺条件。

结合单因素试验结果，分别以TMWEIF蛋白得率（）和巨噬细胞NO释放量（）为响应值设计响应面试验，响应面试验各因素的水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平 Table 1 Factors and levels of response surface analysis

选取正常传代的RAW 264.7细胞，调整细胞密度为2×10，接种到96孔板内，37 ℃、5% CO细胞培养箱中培养24 h后弃掉培养液。每孔加入200L不同浓度的（0.015、0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 mg/mL）TMWEIF溶液，同时设空白对照组（细胞培养液）和模型对照组（10g/mL的LPS溶液）。孵育24 h后，每孔加入20L 1 mg/mL MTT溶液，4 h后弃上清，每孔加入150L 二甲基亚砜，振荡15 min，测定570 nm处吸光度值（OD）。每组设定6个重复。

RAW 264.7细胞的处理方法及分组同1.3.6节，各试验组样品处理24 h，收集各孔上清液按照NO检测试剂盒要求测定NO含量。

参照王丽波等的方法，采用KBr压片法进行FT-IR光谱分析，波数扫描范围4 000～400 cm，分辨率4 cm。

取0.025 mg/mL待测样品水溶液，置于石英比色皿中，以去离子水为参比进行紫外全光谱扫描（200～700 nm）。

采用双缩脲法测定样品中蛋白含量，苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量，TMWEIF蛋白含量测定标准曲线回归方程：=0.775 9+0.017 8，=0.997 2，TMWEIF多糖含量测定标准曲线回归方程：=5.619 5+0.065 2，=0.992 2。计算公式如下

式中为由BSA（葡萄糖）标准曲线求得的蛋白（多糖）浓度，mg/mL；为TMWEIF水溶液总体积，mL；为TMWEIF质量，g。

参照陈振家等的方法，将1 mg/mL待测样品水溶液于190～240 nm范围进行圆二色光谱扫描，以去离子水为参比。

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》。取适量样品与6 mol/L HCl置于安瓿瓶中，酒精喷灯灼烧封口，于110 ℃烘箱中水解22 h，取出冷却至室温，旋蒸，0.02 mol/L HCl定容至25 mL，0.22m滤膜过滤，移至进样瓶中待测，重复3次。

1.4 数据处理与统计方法

试验数据采用 Origin 2019b、SPSS 25.0和Design-Expert 8.0.6 软件进行处理和分析，结果用均值±标准差表示，显著性水平为<0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

由图1 a可知，当液料比由10∶1增至40∶1 mL/g时，TMWEIF中蛋白得率升高，得率在液料比40∶1 mL/g时较高，为7.62%。这是因为较小的液料比使溶液体系较黏稠，无法析出更多的有效成分，但随着液料比的增加，松茸粉充分溶解，使蛋白得率逐步上升。当液料比过大时，蛋白质分子与水之间的扩散作用会影响TMWEIF中蛋白的溶出，导致得率有所下降，因而液料比由40∶1增至50∶1 mL/g时，TMWEIF中蛋白得率降低。

如图1 b所示，TMWEIF中蛋白得率随提取时间的延长呈上升趋势，当提取150 min时，蛋白得率达到最大（<0.05）。这是因为随着提取时间的延长，松茸颗粒膜逐渐破裂，增加有效成分溶出，蛋白得率上升。

图1 c所示，在10～30 ℃提取温度之间，蛋白得率缓慢上升，30 ℃时，蛋白得率升至最高。这可能是因为在较低的温度下，溶液黏度较高，扩散系数较低，温度升高加速分子运动，蛋白析出加快。

图1 液料比、提取时间和提取温度对蛋白得率的影响 Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, extraction time and extraction temperature on yield of protein

2.2 响应面优化TMWEIF蛋白的提取工艺试验结果

在单因素试验的基础上，分别以松茸蛋白得率（）和巨噬细胞NO释放量（）为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，对15个试验点的响应值进行回归性分析。试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果 Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

运用Design-Expert 8.0.6软件进行多元回归拟合，得到的回归方程如下

式中、和分别为液料比、提取时间和提取温度的编码值。

响应面优化试验结果的方差分析显示，两个响应值的模型决定系数分别为0.884 8、0.799 3，校正后分别为0.731 1、0.598 5，表明模型的相关性良好。和的回归模型均是显著的（<0.05）；失拟项均不显著（>0.05），表明模型方程和试验拟合度良好，能较好解释响应中的变异。此外，两个模型的变异系数均小于5%，说明模型对响应值的置信度良好，该模型可以很好地反映试验的真实性。综上所述，此回归模型对两个响应值的拟合程度较好，试验误差较小。

利用响应面模型可拟合出2个响应值对试验因素交互作用的三维空间曲面图，以直观表示响应值的变化趋势及各个因素对于响应指标的影响变化，二维等高线图则进一步展现每个因素间的交互作用并确定最优点。

图2是三因素交互作用对的影响的三维图形。如图2所示，图a、b等高线偏向于圆形，曲面平缓，液料比与提取时间和提取温度的交互作用均不显著（>0.05）；图c等高线近似椭圆，曲面图c陡峭，提取时间和温度的交互作用显著（<0.05）。根据值的大小，判定3个因素对的影响力是：>>。

图2 各因素交互作用对蛋白得率（Y′）影响的响应面图 Fig.2 Response surface map of the interaction of various factors on yield of protein (Y′)

图3是3个试验因素交互作用对RAW 264.7细胞NO释放量（）影响的三维图形。如图3所示，等高线图形均趋向于圆形且曲面坡度较平，两两因素间交互作用均不显著（>0.05）。根据值的大小，判定3个因素对的影响力是：>>。

图3 各因素交互作用对巨噬细胞NO释放量（Y"）影响的响应面图 Fig.3 Response surface map of the interaction of various factors on NO release amount from macrophage (Y")

响应面优化试验预测结果显示，优化工艺参数为液料比45.11∶1 mL/g、提取时间142.07 min、提取温度20 ℃；优化工艺参数为液料比30∶1 mL/g、提取时间126.57 min、提取温度20 ℃。结合实际操作可行性，对和的优化工艺参数予以改良并进行3次重复验证试验。优化参数为液料比45∶1 mL/g、提取时间140 min、提取温度20 ℃，所得提取物记为TMWEIF-1；优化参数为液料比30∶1 mL/g、提取时间120 min、提取温度20 ℃，所得提取物记为TMWEIF-2。结果显示，、蛋白得率分别是8.07%±0.11%、7.06%±0.09%；提取的活性因子TMWEIF-1、TMWEIF-2的NO释放量分别是（3.68±0.03）g/mL、（4.11±0.17）g/mL，二者具有显著性差异（<0.05）。所得实际值与预测值接近，表明各工艺参数准确可靠。

2.3 傅里叶红外光谱分析

TMWEIF的FT-IR谱图如图4 a所示，对于TMWEIF-1，其在3 398 cm处存在-O-H伸缩振动吸收峰，来源于TMWEIF中的蛋白质；2 933 cm处的吸收峰属于酯类的亚甲基-C-H的反对称伸缩振动吸收峰，这来源于其中的糖链或蛋白质。同时，对于TMWEIF-2，其分别在3 402 cm和2 929 cm处存在-O-H和酯类的亚甲基-C-H的吸收峰，与TMWEIF-1相近，表明它们组分相似。

TMWEIF-1和TMWEIF-2在1 628 cm和1 591 cm处的吸收峰是蛋白质的酰胺Ⅰ带的特征吸收峰，来源于C=O的伸缩振动。酰胺Ⅰ带的特征吸收峰的存在说明了TMWEIF中含有一定量的蛋白质。

TMWEIF在1 200～700 cm范围内主要出现1 080 cm、1 037 cm、1 029 cm、932 cm和888 cm5个吸收峰，推测是多糖类物质吸收峰。TMWEIF-1在1 080 cm(-C-O-)和1 029 cm(-C-C-)处的特征吸收峰表明了葡聚糖的存在，932 cm和888 cm附近的吸收峰表明其中既含有-型糖苷键，也含有-型糖苷键；而TMWEIF-2中1 080 cm、1 037cm和888cm的吸收峰表明其中存在葡聚糖且主要是-型糖苷键。

综上所述，FT-IR光谱吸收峰特征显示，TMWEIF-1和TMWEIF-2中蛋白质和多糖物质的吸收峰较强，表明TMWEIF-1和TMWEIF-2中主要含有的成分是蛋白质和多糖类物质。这与TMWEIF基本组成含量测定结果相一致。

2.4 紫外光谱分析

如图4 c所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在200 nm附近有一强吸收峰，260~280 nm之间有一个弱的吸收峰，表明TMWEIF中含有一定量的多糖和蛋白类物质，这与FI-IR光谱分析结果一致。此外TMWEIF-1的紫外光谱扫描曲线位于TMWEIF-2的曲线之上，表明以蛋白得率为响应值优化的提取工艺所得TMWEIF-1的蛋白和多糖含量高。这与TMWEIF基本组成含量测定结果相一致。

2.5 TMWEIF基本组成分析

TMWEIF中的多糖含量和蛋白含量测定结果显示，TMWEIF-1、TMWEIF-2的多糖含量分别为（306.95±1.16）mg/g、（304.98±1.35）mg/g，二者之间无显著性差异（>0.05）；蛋白含量分别为（132.14±4.43）mg/g、（107.78±4.45）mg/g，二者之间具有显著性差异（<0.05）。

2.6 圆二色谱分析

利用圆二色谱可以解析蛋白质的二级结构组成，如图 4 d所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在190 nm 处呈现负吸收峰，在205 nm附近存在正吸收峰，表明TMWEIF中的蛋白含有大量的-转角结构；TMWEIF-2较TMWEIF-1相比，TMWEIF-2中-转角结构含量更高（72.00%±2.92%，<0.05）。此外，TMWEIF-1和TMWEIF-2均在210 nm附近有一负峰，表明TMWEIF含有-螺旋结构，且TMWEIF-1含有更高比例的-螺旋（39.88%± 3.56%，<0.05）。而研究表明，-螺旋和-折叠代表蛋白质分子的有序性，-转角和无规则卷曲结构均反映蛋白质分子松散程度。这说明了TMWEIF-1中的蛋白质有序性更好，TMWEIF-2中蛋白相对较松散。而TMWEIF-2诱导巨噬细胞释放NO的能力更高，可能与其相对松散的结构从而能暴露出更多的作用位点有关。

图4 TMWEIF的傅里叶红外光谱、氨基酸组成、紫外光谱和圆二色谱分析 Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy, amino acid composition, ultraviolet spectrum and circular dichroism analysis of TMWEIF

2.7 氨基酸组成分析

两组TMWEIF的氨基酸含量如表3所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的氨基酸均为17种，氨基酸含量无显著性差异。从总氨基酸含量（TAA）来看，氨基酸组分总含量平均值为9.7%，两种TMWEIF中必需氨基酸（EAA）含量较丰富（>0.05），EAA平均含量占TAA的27%，EAA/NAA分别为38.43%、37.77%，说明TMWEIF具备良好的营养价值。两组TMWEIF中氨基酸含量高低排序一致，含量较高的依次是谷氨酸和天冬氨酸，分别占氨基酸总量的34.65%、35.65%，2种氨基酸属于鲜味氨基酸，符合松茸鲜味浓郁的特征。另有研究表明，谷氨酸在生长的关键时期包括快速生长的新生儿时期扮演着重要角色，可增强机体免疫细胞的免疫功能。本研究对NO的测定结果表明TMWEIF能够促进巨噬细胞释放NO，发挥免疫调节的作用，而TMWEIF中丰富的谷氨酸则可能是其具备良好免疫活性重要原因之一。此外，谷氨酸还具有对大多数区域的神经元兴奋作用，参与海马区的学习记忆过程，所以TMWEIF具有开发提高免疫力和记忆力食品的应用潜力。

表3 TMWEIF的氨基酸含量分析 Table 3 Analysis of amino acids contents of TMWEIF mg·g-1

如图4 b所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的必需氨基酸、疏水氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸的百分含量相近。曾有研究发现，食源性蛋白的免疫效果与其氨基酸组成及含量有关，特别是疏水氨基酸和碱性氨基酸。TMWEIF中疏水氨基酸和碱性氨基酸平均占氨基酸总量的48%。因此，TMWEIF可能具备良好的免疫效果，这与RAW264.7细胞NO释放量测定结果相符。

综上所述，TMWEIF中所含氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量较丰富，但TMWEIF-2中与免疫效果密切相关的谷氨酸、疏水氨基酸和碱性氨基酸相对含量占比略高，基于营养价值和潜在生物活性两方面考虑，TMWEIF提取工艺2更具有免疫活性因子制备的应用价值。

3 结 论

1）基于响应面法，以蛋白得率为指标确定了松茸水提免疫活性因子1（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-1）优化的工艺参数：液料比45∶1 mL/g、提取时间140 min、提取温度20 ℃；以巨噬细胞NO释放量为指标确定了松茸水提免疫活性因子2（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-2）的优化的工艺参数：液料比30∶1 mL/g、提取时间120 min、提取温度20 ℃。

2）TMWEIF-1和TMWEIF-2主要成分均为蛋白质和多糖，所含蛋白质二级结构为-螺旋和-转角，所含多糖以-型糖苷键的葡聚糖为主；TMWEIF-2中蛋白质-转角比例显著高于TMWEIF-1（<0.05），蛋白相对较松散。TMWEIF-2中与免疫活性高度相关的谷氨酸、疏水氨基酸和碱性氨基酸的总量高于TMWEIF-1，NO释放量显著高于TMWEIF-1。并且，TMWEIF-2制备工艺的液料比小，提取时间短。因此，TMWEIF-2的制备工艺参数更具应用前景。

本研究为松茸源免疫活性因子开发利用提供了理论依据。今后将对松茸多肽和松茸多糖进行进一步的免疫活性研究。