紫斑牡丹单瓣与半重瓣花粉超微结构及生理生化特性比较

赵 萍，唐 红*，刘兴宇，何丽霞

(1 甘肃农业大学 林学院，兰州 730070；2 甘肃农业大学 信息科学技术学院，兰州 730070；3 甘肃省牡丹工程研究中心，兰州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)为芍药科芍药属落叶小灌木，是中国重要的观赏植物与油料作物之一，同时还具有抗寒、抗旱、耐瘠薄等特性[1]。主要分布于四川北部、甘肃南部和陕西南部(太白山区)等地[2]。牡丹花开花时间较早，花朵寿命较为短暂，单朵花从开放到衰老的时间仅有7～10 d，直接影响到牡丹花朵的观赏价值，产量也受到较大程度的影响[3]。再者，因地域的不同，牡丹花开放的时间也有较大的差异性，因其开花时间的短暂性，花粉的寿命也极为短暂，对育种极为不利[4-5]。重瓣牡丹的结实性能极为低下，对其油用价值有极大的影响，制约了牡丹的进一步发展[6]。

花粉是种子植物的微小孢子堆，花粉由雄蕊中的花药产生，由各种方法到达雌蕊，使胚珠授粉[7]。蔡祖国等[8]对矮牡丹花粉活力测定及花粉萌发特征的研究认为，硼酸和蔗糖对矮牡丹花药离体萌发有着重要的影响。盖伟玲等[9]通过研究4个牡丹品种的花粉在固体培养基萌发的情况，认为培养6 h左右是计算牡丹花粉萌发率的适宜时期。秦瑶等[10]研究表明单瓣品种萌发时间比重瓣品种萌发时间短且集中。成熟花粉的生活力因不同种类而变化很大。花粉保护酶活性、丙二醛(MDA)和蛋白质含量保持稳定是花粉保持高活力的生理特征[9]。保护酶活性的高低也是反映花粉活力的重要指标。保护酶活性、MDA和蛋白质含量的高低可以反映花粉的健康程度，与花粉寿命及生活力具有相关性，是花粉萌发力的直接表现[11-12]。目前，有关紫斑牡丹的研究主要集中在引种栽培[2]、遗传学[3]、油用性能[13]等方面。关于其单瓣与半重瓣花粉结构、萌发特性和生理机制方面的系统研究尚未见报道。为此，本研究以甘肃省兰州市榆中县官滩沟紫斑牡丹培育基地紫斑牡丹(表1)为材料，探讨了3个品种(‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’)单瓣与半重瓣紫斑牡丹花粉萌发的最适培养基，不同品种单瓣和半重瓣紫斑牡丹花粉3 种保护酶的活性、蛋白质以及MDA含量，以期确定不同品种单瓣和半重瓣紫斑牡丹花粉生活力检测的最佳、最可靠的培养基配方，明确单瓣和半重瓣紫斑牡丹的花粉活力，探讨单瓣与半重瓣紫斑牡丹花粉保护酶活性、MDA和蛋白质的含量的相关性，为紫斑牡丹单重瓣研究和杂交育种提供理论和试验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

紫斑牡丹源自甘肃省兰州市榆中县官滩沟紫斑牡丹培育基地，于2021年6月中上旬9:00-11：00，采集同一株牡丹植株上同时具有单瓣与半重瓣的将开未开的紫斑牡丹花朵，按品种和单重瓣分别标号，迅速放入冰盒，带回实验室。在实验室中将采回花朵的花萼与外轮花瓣剥去，倒扣在硫酸纸上，置于恒温培养箱内散粉，24 h后取出，一只手用镊子夹住倒置的花朵，另一只手轻弹花朵，收集散落的花粉。将收集好的花粉每个编号各分成两份，一份用于花粉萌发的测定；另一份30 ℃鼓风干燥箱干燥24 h后，分装至10 mL带盖离心管中储存，写好标签，备用。品种性状见表1。

表1 紫斑牡丹品种说明

1.2 花粉超微结构观察

采集完全成熟的花药，放入2.5%戊二醛溶液中固定4 h以上，生理盐水清洗3次，每次10 min，30%、50%、70%、80%、90%、100%无水乙醇梯度脱水，醋酸乙戊二酯置换，二氧化碳临界点干燥，用镊子将花药壁撕破，将花粉分别均匀地撒在粘有双面胶带的样品台上，真空喷金镀膜，以备观察、拍照。

1.3 花粉萌发最适培养基的筛选

选取对植物花粉萌发影响较大的硼酸和蔗糖作为试验的2 个影响因素。

培养基配制:由某一浓度蔗糖、硼酸和琼脂配制而成。将硼酸配制成0.1 g·L-1的溶液，用移液管吸取所需用量加入容量瓶中，将琼脂称量后也加入容量瓶中，加蒸馏水定容后加热至沸腾，冷却至30 ℃。

用吸管吸取培养液，滴在载玻片上，待其凝固后，蘸取花粉均匀播种在液滴上，将播种有花粉的载玻片放在铺有吸水纸的培养皿中，置于恒温培养箱中培养，温度为(25±1)℃、全光照培养6 h后，在显微镜下观察。取4个视野，数取花粉总数及萌发数，计算萌发率。统计时，以花粉管长度等于或大于花粉直径者为萌发。每个处理设3个重复。花粉萌发率计算如下：

花粉萌发率=花粉管长度大于花粉直径的花粉数/观察花粉数×100%。

培养基组分优化:用A、B两组配方。

配方A:蔗糖(50、100、150和200 g·L-1)+硼酸0.1 g·L-1+10 g·L-1琼脂;

配方B:在配方A已初步确定蔗糖浓度的基础上，硼酸浓度设置4个水平(0.05、0.10、0.15和0.20 g·L-1)。

1.4 花粉蛋白质和丙二醛含量及3种保护酶活性

粗酶液的提取：称取(0.100±0.01) g紫斑牡丹花粉，放入4 ℃预冷研钵中，加入 2 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)，匀速研磨 30～40 s，之后将研磨液转移至10 mL离心管，定容至刻度线。将提取液于10 000 r/min 4 ℃离心 20 min，取出上清液，保存至4 ℃冰箱备用待测。

可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法，过氧化氢酶测定采用(CAT)可见光分光光度法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)测定采用氮蓝四唑法，过氧化物酶(POD)测定采用愈创木酚法，试剂盒由天津市光复科技发展有限公司提供。

数据用 Excel 2010、SPSS 24和Origin2021进行作图与方差分析。

2 结果与分析

2.1 花的形态与花粉特征

单瓣‘象牙白’花白色，花粉数量多(图1， A)。半重瓣‘象牙白’花粉较少，部分雄蕊瓣化为花瓣(图1， B-C)。花粉粒为3个萌发沟，是孢粉学研究的最初类型，单瓣‘象牙白’平均极轴长为50.98 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道轴长为23.51 μm(21.73～26.69 μm)，P/E≈2.18(图2， A)。半重瓣‘象牙白’平均极轴长为43.79 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道轴长为23.42 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈1.88(图2， B)。畸形花粉长在 10～40 μm 之间，总体观不饱满、空瘪，多为勺状、三棱状、不规则状等，单瓣‘象牙白’畸形花粉约占观察花粉总数的 20.50%；半重瓣‘象牙白’畸形花粉约占观察花粉总数的 35.40%。

图1 3个紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花形态特征比较

单瓣‘美人面’花粉色，花粉多数(图1， D)。半重瓣‘美人面’花粉较多，部分雄蕊瓣化为花瓣(图1， E-F)。单瓣‘美人面’平均极轴长为49.51 μm(44～56.39 μm)，平均赤道轴长为24.19 μm(22.04～26.51 μm)，P/E≈2.05(图2， C)。半重瓣‘美人面’平均极轴长为52.37 μm(49.11～54.29 μm)，平均赤道轴长为25.55 μm(20.67～25.55 μm)，P/E≈2.05(图2， D)。畸形花粉长在 10～40 μm之间，总体观多为三棱状、不规则状等，单瓣‘美人面’畸形花粉约占观察花粉总数的 19.50%；半重瓣‘美人面’畸形花粉约占观察花粉总数的 35.40%。

单瓣‘紫金冠’花红色，花粉多数(图1， G)。半重瓣‘紫金冠’花粉较少，部分雄蕊瓣化为花瓣(图1， H-I)。单瓣‘紫金冠’平均极轴长为49.32 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道轴长为24.08 μm(21.73～26.69 μm)，P/E≈2.06(图2， E)。半重瓣‘紫金冠’平均极轴长为48.16 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道轴长为23.36 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈2.08(图2， F)。畸形花粉长在 10～40 μm之间，单瓣‘紫金冠’畸形花粉约占观察花粉总数的 18.50%；半重瓣‘紫金冠’畸形花粉约占观察花粉总数的27.40%。

图2 3个紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花花粉表观特征比较

2.2 不同培养基对花粉萌发的影响

蔗糖与硼酸对牡丹花粉离体培养具有非常重要的作用，蔗糖能为花粉的萌发提供营养物质[14]，硼酸能够促进花粉对于糖的吸收，促进花粉管壁的形成，提高萌发率[15-16]。从表 2 与表 3 可以看出，蔗糖和硼酸浓度对紫斑牡丹花粉萌发率都有显著影响，总体趋势相同。随着浓度的增加，花粉萌发率呈现上升趋势，到达最适浓度后，又开始下降。蔗糖浓度为100 g·L-1与硼酸浓度为0.15 g·L-1时，花粉萌发率整体最高， 3个品种紫斑牡丹单瓣花粉萌发率均显著高于半重瓣花粉萌发率。紫斑牡丹花粉萌发最优的培养基为蔗糖100 g·L-1+硼酸0.15 g·L-1+10 g·L-1琼脂。在最适宜培养基下，3个品种花粉萌发率分别为：‘象牙白’单瓣(83.62±2.85)%, 半重瓣(72.06±2.55)%；‘美人面’单瓣(78.02±3.94)%，半重瓣(69.88±3.84)%；‘紫金冠’单瓣(61.65±2.28)%，半重瓣(55.92±1.89)%。

表2 不同蔗糖浓度对紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花粉萌发率的影响

表3 不同硼酸浓度对紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花粉萌发率的影响

2.3 紫斑牡丹的单瓣与半重瓣花粉可溶性蛋白含量比较

从图 3可以看出，不同品种紫斑牡丹单瓣与半重瓣花粉可溶性蛋白含量显著不同，同一品种单瓣与半重瓣花粉可溶性蛋白含量也显著不同，单瓣花粉可溶性蛋白含量均显著高于半重瓣花粉可溶性蛋白含量。其中，单瓣‘美人面’花粉可溶性蛋白含量最高，达到17.79 mg·g-1，为半重瓣‘美人面’的1.33倍；‘象牙白’花粉可溶性蛋白含量单瓣与半重瓣的差异最大，单瓣‘象牙白’为半重瓣‘象牙白’的1.53倍；半重瓣‘紫金冠’花粉可溶性蛋白含量最低，为9.31 mg·g-1，为单瓣‘紫金冠’的1.29倍。

图3 紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花粉可溶性蛋白含量比较

2.4 紫斑牡丹的单瓣与半重瓣花粉 MDA 含量比较

从图 4可以看出，不同品种紫斑牡丹花粉MDA含量显著不同，同一品种单瓣与半重瓣花粉MDA含量也显著不同，均为半重瓣花粉MDA含量高于单瓣。其中，半重瓣‘紫金冠’花粉MDA含量最高，达到6.97 μmol·g-1，约是单瓣‘紫金冠’的1.21倍；半重瓣‘象牙白’MDA含量约为单瓣‘象牙白’的1.05倍；半重瓣‘美人面’MDA含量约为单瓣‘美人面’的1.10倍。

图4 紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花粉MDA含量比较

2.5 紫斑牡丹的单瓣与半重瓣花粉保护酶活性比较

2.5.1 SOD活性差异从图 5，A可以看出，不同品种紫斑牡丹SOD活性有显著差异，同一品种单瓣与半重瓣SOD活性显著不同，半重瓣花粉SOD活性均显著高于单瓣花粉；半重瓣‘美人面’花粉SOD活性达到最高，为154.933 U·g-1；单瓣‘紫金冠’花粉SOD活性达到最低，为106.588 U·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉SOD活性为单瓣‘象牙白’的1.13倍；半重瓣‘美人面’花粉SOD活性为单瓣‘美人面’的1.25倍；3号品种单瓣与半重瓣‘紫金冠’花粉SOD活性差异最大，半重瓣‘紫金冠’花粉SOD活性为单瓣‘紫金冠’的1.45倍。

2.5.2 POD活性差异从图 5，B可以看出不同品种紫斑牡丹POD活性有显著差异，同一品种单瓣与重瓣POD活性显著不同，半重瓣花粉POD活性均显著高于单瓣花粉，单瓣‘紫金冠’花粉POD活性达到最高，为271.57 U·g-1，单瓣‘美人面’花粉POD活性达到最低，为102.50 U·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉POD活性为单瓣‘象牙白’的1.23倍；半重瓣‘美人面’花粉POD活性为单瓣‘美人面’的1.18倍；‘紫金冠’单瓣与半重瓣POD活性差异最大，半重瓣‘紫金冠’花粉POD活性为单瓣‘紫金冠’的1.50倍。

2.5.3 CAT活性差异从图 5，C可以看出，不同品种紫斑牡丹CAT活性有显著差异，同一品种单瓣与半重瓣CAT活性显著不同，半重瓣花粉CAT活性均显著高于单瓣花粉，半重瓣‘美人面’花粉CAT活性达到最高，为40.89 mg·g-1，单瓣‘紫金冠’花粉CAT活性达到最低，为37.60 mg·g-1。半重瓣‘象牙白’花粉CAT活性为单瓣‘象牙白’的1.01倍，半重瓣‘美人面’花粉CAT活性为单瓣‘美人面’的1.03倍，半重瓣‘紫金冠’花粉CAT活性为单瓣‘紫金冠’的1.01倍。

图5 不同紫斑牡丹品种单瓣及半重瓣花粉保护酶活性比较

3 讨 论

3.1 不同培养基对紫斑牡丹花粉萌发率的影响

现有研究表明，不同种质牡丹的花粉萌发对于蔗糖和硼酸的需求差异性较大，‘凤丹白’牡丹[17]最适培养基浓度为0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖；西藏‘黄牡丹’[10]、‘大花黄’[18]最适培养基浓度为120 g·L-1蔗糖+45 mg·L-1硼酸；日本牡丹[19]最适培养基浓度为蔗糖50 g·L-1+硼酸1 g·L-1，滇牡丹[20]最适培养基浓度为蔗糖50 g·L-1+10 mg·L-1。本实验研究结果表明，蔗糖和硼酸对于紫斑牡丹的花粉萌发率影响极为显著，这表明在用离体培养法测定花粉萌发率时，蔗糖和硼酸是影响紫斑牡丹花粉萌发的主要因素。紫斑牡丹萌发的最佳培养基为：100 g·L-1蔗糖+0.15 g·L-1硼酸+10 g·L-1琼脂，蔗糖需求与‘凤丹白’牡丹一样，低于西藏‘黄牡丹’、‘大花黄’，高于日本牡丹和滇牡丹；硼酸需求高于‘凤丹白’牡丹、西藏‘黄牡丹’、‘大花黄’和滇牡丹，低于日本牡丹。这种现象表明，不同的牡丹种质花粉对硼酸与蔗糖的适应性不尽相同，这些萌发特性的差异有可能是因为他们的基因型不同而造成的。

3.2 花粉萌发率与蛋白质含量的关系

很多学者在对植物雄性不育这方面的研究中发现,蛋白质的含量与花粉育性息息相关。蛋白质是花药发育过程中积累的营养物质，其作为细胞组成中重要的代谢物质和能源物质，对于花药和小孢子的正常发育都极为重要。花药的正常发育以及小孢子形成过程中的细胞分裂、花粉内外壁形成等，均需蛋白质的参与[21]。花药发育过程中蛋白质的缺失会直接影响花粉正常的新陈代谢，从而导致花粉败育。周国昌等[22]在花药发育过程中提出“物质亏损”，认为营养供应不足将会导致小孢子异常发育。‘美人面’的可溶性蛋白含量最高，而‘象牙白’的萌发率最高，造成这种差异的原因可能与花粉本身的大小、畸形等有关。本研究结果亦证明了这一结论，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’花粉萌发率均表现为单瓣花粉萌发率显著高于半重瓣花粉萌发率，可溶性蛋白含量均表现为单瓣花粉高于半重瓣花粉，这与前人在大白刺[21]、玉米[22]、甜椒[23]等方面的研究结果一致。

3.3 花粉萌发率与MDA含量的关系

MDA是膜脂过氧化的一个重要指标，在花粉发育时期的大量积累会使细胞膜结构遭到破坏或损伤, 从而引起细胞内生理生化代谢的紊乱。MDA含量的高低代表细胞质膜透性的强度，与其是否受到伤害具有密切的相关性[24]。植物材料不同，MDA含量的高低不同。同一品种的紫斑牡丹，但因其半重瓣具有一定的不育性，MDA含量也具有一定的差异。田长恩等[25]认为，不育系花器中脂膜的破坏速度要快于可育花蕾，植物体内含有较高的 MDA 是造成膜脂过氧化增强，造成败育的重要原因。而半重瓣花粉的萌发率也显著低于单瓣花粉萌发率，造成这种现象的原因有花粉畸形、退化；花粉外观畸形或结构异常；孢子囊或小孢子退化和花粉功能异常等[26-27]。半重瓣花粉MDA含量显著高于单瓣花粉，造成这种差异的原因可能是MDA的积累导致物质代谢损亏，活性氧毒害的程度较高，使细胞膜系统受到破坏或损伤，造成细胞内生理代谢紊乱[28]。本研究结果也证实了这一结论，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣花粉MDA含量显著低于半重瓣，由此推测，半重瓣紫斑牡丹萌发率低可能与花蕾中MDA的快速积累有关。

3.4 花粉萌发率与 3 种保护酶活性的关系

植物花粉在利用氧的过程中会形成活性氧, 这些活性氧会对植物本身产生毒害作用, 从而会发生体内相关组织的生理生化紊乱的现象, SOD、POD、CAT等抗氧化酶可以帮助清除植物体内积累的过剩有氧自由基, 防止活性氧过度积累而造成膜质受损。研究表明，保护酶活性一定程度上是生物体机能维持的重要指标[29-31]。保护酶活性的高低与植物花粉的正常发育具有相关性，这些保护酶与植物花粉败育的理论研究，主要有两种观点:一种认为，败育花粉中保护酶活性下降, 致使活性氧水平升高，膜脂过氧化作用增强而使细胞受损, 引起小孢子生长发育异常从而导致植物花粉败育；另一种观点认为，败育花粉中保护酶活性水平高于其正常花粉，认为这是花粉败育对其体内活性氧水平升高的应答反应[32]。本研究结果与第二种观点一致，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣花粉的SOD、POD和CAT活性均显著低于半重瓣。保护酶活性偏高将加速生长素的分解、降低生长素活性,导致生长素浓度偏低, 对营养物质的竞争不利, 从而影响花粉的正常发育[33]。

在植物的代谢过程中会产生活性氧等有毒物质,这些物质能够穿透生物膜而诱发膜脂质过氧化作用,从而损伤植物组织。半重瓣花药中较高的SOD活性可能是导致花粉萌发率较低的一个重要因素。植物体内较高的POD 活性会促使生长素氧化分解，导致不能满足花药所需要的营养物质，另外造成花序中乙烯大量积累，造成细胞衰老，引起花药败育。CAT是一种保护性酶,能够有效地清除生物体内的产生的自由基对细胞的伤害作用。本实验研究结果表明，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’半重瓣花粉SOD、CAT、POD活性均高于单瓣花粉，这与何思等[23]在苎麻中的研究结果相一致。

4 结 论

紫斑牡丹花粉小粒、瘪粒和畸形是导致其萌发率较低的主要原因。‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’花粉离体培养最佳培养基配方为：100 g·L-1蔗糖+0.15 g·L-1硼酸+10 g·L-1琼脂。‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣花粉离体培养萌发率均显著高于半重瓣，分别为：单瓣‘象牙白’(83.62 ±2.85)%；半重瓣‘象牙白’(72.06±2.55)%；单瓣‘美人面’(78.02±3.94)%；半重瓣‘美人面’(69.88±3.84)%；单瓣‘紫金阁’(61.65±2.28)%；半重瓣‘紫金阁’(55.92±1.89)%。

本研究对‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣与半重瓣花粉可溶性蛋白含量、MDA含量、SOD、POD和CAT活性指标进行分析，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣花粉的可溶性蛋白含量均高于半重瓣花粉，‘象牙白’、‘美人面’和‘紫金冠’单瓣花粉MDA含量和3种保护酶活性均低于半重瓣花粉。花粉体内蛋白质亏损和MDA、CAT、SOD、POD的积累可能是引起半重瓣紫斑牡丹花粉萌发率低下和败育的生理原因之一。