囊胚培养为主时解冻卵裂期胚胎移植的妊娠结局分析

张小霞，王辉田，李 涛

（中山大学附属第三医院生殖中心，广东广州 510630）

近年来囊胚培养已成为各生殖中心的主流，延长胚胎培养至囊胚阶段可以更好地评估胚胎的发育潜能，选择最优的胚胎移植，让病人更快获得妊娠，尤其是单囊胚移植，可以在控制多胎妊娠的同时维持高的临床妊娠率；另一方面，囊胚移植时子宫内膜更接近生理状态，容受性更好；囊胚比卵裂胚更耐受低温冻存，具有解冻复苏率更高等优势［1-2］。但是，全部卵裂胚行囊胚培养存在一定风险，一旦养囊失败，病人面临无胚胎移植的风险［3］。因此，为最大限度地鼓励患者接受囊胚培养，保证病人有胚胎移植的机会，本中心对大部分病人在胚胎发育第三天冷冻保存1～2 枚胚胎，剩余胚胎全部行囊胚培养。囊胚移植可以获得相对更高的种植率和妊娠率，因此，在解冻移植周期，通常优先选择移植囊胚，本中心解冻单囊胚移植的总体临床妊娠率65%左右，与国内外报道的囊胚移植的妊娠率近似［4-5］。但在总的解冻胚胎移植周期中，仍有相当比例的解冻卵裂期胚胎移植。因此，在以单囊胚移植为主的移植策略下，这些冷冻卵裂期胚胎来自哪些人群、胚胎质量如何、妊娠结局如何？本研究根据是否行囊胚培养及是否有可用囊胚，将解冻卵裂期胚胎移植分为无养囊组、养囊失败组、养囊成功组，对近5 年解冻卵裂期胚胎移植结局进行了相应的分析。我们纳入了本中心2015 年9 月至2020 年6 月共1 607 例卵裂期胚胎解冻周期，分析了不同群体的患者基本特征，妊娠情况，影响妊娠结局的因素等，评估D3卵裂胚冷冻及移植的临床价值，为目前以养囊为主的临床方案提供反馈，为进一步优化胚胎冷冻及移植策略提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究已取得中山大学附属第三医院生殖伦理委员会批准，患者均签署知情同意。回顾性分析本中心2015 年9 月至2020 年6 月的解冻卵裂期胚胎移植周期，排除女方伴有子宫内膜、宫腔粘连等宫腔疾病，以及解冻胚胎来源于不同取卵周期、冻卵周期、晚补救卵裂胚等特殊情况，共包括1 607例解冻卵裂期胚胎移植。根据是否在第三天进行囊胚培养及是否有可用囊胚，分成无养囊组（1 200例）、养囊失败组（98 例）和养囊成功组（309 例）三个组。养囊失败组定义为无可利用囊胚形成，无囊胚移植史；养囊成功组为有可用囊胚，且有移植冷冻囊胚但未能妊娠史。养囊成功组共486 例，但本研究仅纳入至少有一次解冻囊胚移植失败史的病例（309例），本组也不包括D5新鲜移植后无冻存囊胚，或解冻时优先解冻卵裂胚，以及解冻囊胚成功妊娠（解冻卵裂胚生育二孩/三孩）的患者。

1.2 方法

1.2.1 体外受精与胚胎培养 当2～3 个主导卵泡直径达到18 mm 时，当日抽血查性激素促卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P），使用的仪器是罗氏Cobas e602 化学发光仪检测，使用人绒毛膜促性腺激素（HCG）4 000～10 000 U 或者重组hCG 250 μg 进行扳机，注射后36～38 h取卵。根据常规体外受精（IVF）和卵胞浆内单精子注射（ICSI）的适应症，结合男方当日精液优化处理后情况选择授精方案。

1.2.2 胚胎评分 根据胚胎卵裂球数目，卵裂球大小均一性以及碎片量对胚胎进行评分。卵裂球1级：细胞大小均匀，形态规则，胞质均匀清晰；2 级：细胞大小略不均匀，形态略不规则；3 级：细胞大小明显不均；碎片评分：1分：碎片＜10%；2分：大多数碎片局部分布，碎片量10%～25%；3 分：碎片量＞25%，≤50%。卵裂球数目小于四个同时碎片量≥50%时为不可用胚胎。优质卵裂期胚胎为第三天卵裂球数目6～10 个，细胞大小均匀，碎片量＜10%。

1.2.3 胚胎的冷冻及解冻 所有胚胎冷冻、解冻均采用日本加藤商品化试剂套装。胚胎冷冻时将胚胎放入平衡液（equilibration solution，ES），计时，室温10 min，接着将胚胎移入玻璃化冷冻液（vitrification solution，VS）60 s，当时间还剩10 s 左右时，将胚胎放在载杆尖端处，立即投入液氮中。胚胎解冻时找出患者需要解冻的胚胎，双人核对载杆标签上胚胎个数、胚胎阶段、冷冻日期，将载杆立即浸入解冻液1（warming solution 1，WS1）中37 ℃，轻轻晃动使胚胎从载杆滑入解冻皿，1 min 后将胚胎转移至WS2 液中，室温计时3 min，接着转移至WS3，室温5 min，再移至2 个WS4 中，室温各3 min，最后转移至3037 移植皿，放入培养箱等待移植，卵裂期胚胎解冻后至少一半及以上卵裂球复苏定为胚胎存活。

1.2.4 内膜的准备 主要的内膜准备方案是自然周期和人工周期方案（HRT）。自然周期适合于排卵正常的患者，于月经周期第10 天开始B 超监测排卵及内膜厚度，当卵泡直径＞14 mm 时，每天监测尿LH，同时监测激素LH、E2、P 水平，当血LH 值大于基础值2倍以上或者＞20 U/L，则认为血LH出峰。在尿LH 峰出现当天（D0）抽血查激素LH、E2、P，移植时间在LH 峰值后的第三天（D3）或者第五天（D5）。人工周期方案（HRT）主要适用于各种原因导致的低雌激素水平或者无自然排卵等，从月经周期或者撤退性出血的第1～3 天开始，戊酸雌二醇2～8 mg/d，8～14 d后根据B超监测的内膜情况，调整剂量。如果内膜厚度小于8 mm，或者E2 水平＜200 pg/mL，添加芬吗通1～2 mg 阴道给药。当内膜达到8 mm 后，抽血查E2，当E2≥200 pg/mL 时每天肌注40～60 mg 黄体酮，黄体酮注射第4 天移植第三天卵裂期胚胎。

1.2.5 妊娠检查 胚胎移植后14 d，晨尿查hCG 或测定血β-hCG 水平判定是否妊娠。临床妊娠定义为孕7周B 超探及孕囊，活产为获得孕28周以上活产胎儿。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计分析软件分析，定量资料基本服从正态分布用均值±标准差（）表示，3 组比较采用单因素方差分析，不符合正态分布数据用中位数和四分位数M（P25～P75）表示，3组间采用非参数检验。率与构成比采用χ2检验；有临床意义的因素采用logistic 回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳入解冻胚胎移植周期的基本情况

本中心2015年9月至2020年6月总共5 327例解冻胚胎移植周期，其中3 378 例解冻囊胚移植周期，解冻卵裂期胚胎移植周期总共1 907例，排除子宫内膜因素及特殊情况如积攒胚胎等的卵裂期胚胎移植，本研究共包括1 607 例解冻卵裂期胚胎移植，占总解冻周期的30.2%，本中心近年来高龄病人增加，相应增加了解冻卵裂胚移植在总的解冻周期中的比例，以及无养囊组在总研究人群中的占比（表1）。

2.2 三组人群的基本临床特征及妊娠结局比较

共纳入1 607 个解冻卵裂胚周期，其中未养囊组1 200 例、养囊失败组98 例（占总养囊周期数的2.1%）、养囊成功但移植解冻囊胚失败组共309 例（占总体养囊周期数的6.6%）。分析3 组人群的年龄、不孕年限、女方BMI、授精方式、不孕类型、获卵数、D3优胚数、移植胚胎数等基本资料，结果发现3组间的女方年龄、基础FSH、BMI、原发不孕占比、获卵数、D3 优胚数均有统计学差异。未养囊组女方年龄更高，基础FSH更高，原发不孕占比更低，获卵数，D3优胚数均显著低于其他两组。3组人群的不孕年限、IVF受精占比差异无统计学意义，P＞0.05（表1）。3 组间移植胚胎数无明显差异。至少移植1 枚优胚的比例在无养囊组最低，但差异无统计学意义，HRT 的比例在3 组间差异无统计学意义。临床妊娠率在3组间存在统计学差异，P＜0.001（表1），养囊成功组即使有移植解冻囊胚失败史，移植卵裂期胚胎的临床妊娠率仍然显著高于其他两组，即46.9%vs.36.7%（养囊失败组）vs.32.0%（未养囊组）。但是当病人年龄＜35岁时，3组间临床妊娠率差异无统计学意义，病人年龄在35～40 之间时，临床妊娠率有显著差异，养囊成功组显著高于其他两组，P=0.012，年龄大于40岁时仍然存在此趋势，由于病例数较少，差异无统计学意义。3 组间异位妊娠率、早期流产率、多胎率差异无统计学意义（表1）。

表1 解冻卵裂期胚胎移植患者基本资料及临床结局分析Table 1 Baseline characteristics and clinical outcome of the patients undergoing thawed cleavage-stage embryo transfer

2.3 影响未养囊组妊娠结局的多因素回归分析

未养囊组的临床妊娠率随年龄增加而明显降低，＜35 岁临床妊娠率为49.0%，35～40 岁妊娠率30.4%，＞40岁妊娠率13.1%，差异有统计学意义，与＜35 岁人群相比，＞40 岁人群妊娠率下降明显，OR 95%CI 为0.143（0.096，0.212），P＜0.001。72.8%患者至少有1 枚优胚移植，移植至少一枚优胚妊娠率显著增加，OR 95%CI 为1.565（1.076，2.276），P=0.019。此组病人影响妊娠率的主要因素是病人年龄，及移植胚胎质量（是否移植优胚）。获卵数、D3优胚数、受精方式及内膜准备方案不影响妊娠结局。此组病人异位妊娠率1.3%，早期流产率24.2%，双胎率24.2%（表2）。

表2 未养囊患者中影响解冻卵裂胚移植妊娠结局的logistic分析Table 2 Multiple logistic regression analysis of factors associated with the clinical pregnancy rate of patients without blastocyst culture

2.4 影响养囊失败组妊娠结局的多因素回归分析

养囊失败组病例数较少（98 例），临床妊娠率略高于未养囊组（36.7%vs.32.0%）。75.5%患者至少有1 枚优胚移植，临床妊娠率随年龄增加有逐渐降低的趋势，＜35岁妊娠率47.8%，35～40岁妊娠率32.4%，＞40 岁妊娠率16.7%，差异无统计学意义。移植胚胎质量（是否移植优质胚胎）不影响妊娠率，33.3%vs.37.8%。此外，获卵数、D3优胚数、受精方式均不影响该组妊娠率（表3）。

表3 养囊失败病人中影响卵裂胚冻胚移植妊娠结局的logistic分析结果Table 3 Multiple logistic regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy rate of patients who had no transferable blastocysts

2.5 影响养囊成功组妊娠结局的多因素回归分析

养囊成功组临床妊娠率最高，46.9%。年龄不影响妊娠结局，＜35岁妊娠率与35～40岁妊娠率无差异（49.2%vs.47.1%），＞40 岁妊娠率略低（26.1%），但是病人例数较少，差异无统计学意义。获卵数、D3 优胚数、可用囊胚数、移植胚胎质量（是否移植优胚）均不影响该组妊娠率，P＞0.05。剩余冻存囊胚数≥1 的妊娠率显著高于无囊胚剩余组，OR 95%CI 为4.991（2.558，9.739），P＜0.001，此外，ICSI 组临床妊娠率略高于常规IVF 组，OR 95%CI为1.78（0.99，3.22），P=0.055（表4）。

表4 养囊成功患者影响解冻卵裂胚移植临床妊娠率的logistic回归分析Table 4 Multiple logistic regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy rate of patients who had failed pregnancy with frozen blastocyst transfer（s）

3 讨论

解冻胚胎移植已经有超过30 年的历史，临床妊娠率逐年提高，尤其是近年来采用玻璃化冷冻技术，囊胚复苏率超过95%［6］。玻璃化冷冻采用高浓度的冷冻保护剂，在快速降温过程中形成玻璃态，防止冰晶形成导致的细胞内结构损伤［7］。另一方面，随着胚胎培养技术的进步，囊胚培养、囊胚移植逐渐常态化，成为较多IVF 中心的主要移植模式，尤其是解冻单囊胚移植。为鼓励病人选择囊胚培养及移植，本中心为养囊病人常规冻存1 至2 枚卵裂期胚胎（年轻反应好，或不适宜双胎者冷冻1 枚；D3 胚胎质量稍差者冷冻2 枚，1 枚优胚加1 枚质量中等的胚胎），其余胚胎养囊，以防止养囊失败患者无胚胎移植。高龄或者卵巢储备差的患者仍然常规行卵裂期胚胎冻存或移植。因此，本研究的目的是分析在目前以养囊及解冻囊胚移植为主的情况下，解冻卵裂期胚胎移植的妊娠结局及影响结局的因素。

本研究将解冻卵裂期胚胎移植周期分为无养囊组、养囊失败组及养囊成功组，D3 无养囊组主要为高龄患者，以及卵巢储备差的年轻患者。我们的结果与既往研究一致，影响妊娠率的主要因素是年龄以及胚胎质量（表2）。小于35岁，临床妊娠率可达49.0%（222/453）。如果同时移植优质胚胎，临床妊娠率可达54.9%。因此，年轻少卵、胚胎评分高的患者无需养囊，解冻卵裂胚移植可获得与囊胚移植相似的临床结局，而囊胚培养的结果受体外培养条件的影响，培养液PH、渗透压、培养环境的氧浓度、温度、不同品牌的培养液、不同批号的培养液等均影响胚胎体外发育，造成一定程度的胚胎损耗［8-9］。因此，对于获卵数及D3 胚胎数有限的患者，卵裂期胚胎冷冻及移植是更安全的选择。

囊胚培养是通过延长胚胎培养，选择更有发育潜能的胚胎，因此囊胚移植周期的种植率和活产率明显高于卵裂期胚胎移植［10-11］。虽然体外胚胎培养技术逐年提高，但是目前尚不能完全模拟体内环境，尤其是培养环境易于波动的实验室，延长胚胎培养至囊胚阶段可能进一步影响胚胎发育潜力。另外部分患者的胚胎对外界环境可能更加敏感，早期冻存卵裂期胚胎可以保存胚胎的发育潜能。因此，为防止养囊失败病人无胚胎移植，同时保证囊胚培养的效果，本中心通常仅冷冻1 枚优质卵裂期胚胎或者1 枚优胚加1 枚质量中等的胚胎，目的是把尽可能多的优质卵裂期胚胎用于囊胚培养，同时尽量降低解冻移植时的双胎率。本研究中有98 例养囊失败，占总养囊周期数的2.1%。此组病人无可用囊胚形成，提示此组病人总体D3 胚胎质量较差，发育潜能较低，解冻移植后此组病人的临床妊娠率明显低于养囊成功组（36.7%vs.46.9%），但是略高于无养囊组，表明即使部分病人的胚胎体外无法发育到囊胚，早期移植后体内可以继续发育并成功种植。此组病人例数较少，多因素回归分析显示年龄、获卵数、D3 优胚数、受精方式及移植胚胎质量（是否移植优胚）不影响妊娠结局（表3），提示目前的常规指标，尤其是D3 胚胎形态评分不能预测胚胎的发育潜能，以及妊娠结局。与全部胚胎养囊相比，在D3常规冷冻1至2枚胚胎可以给部分病人带来额外的妊娠机会。

对于养囊成功组的病人，已经优先移植了1 至多枚囊胚，部分病人已经移植完所有囊胚，有一次或者多次囊胚移植失败史后选择解冻卵裂胚移植。临床妊娠共145例，其中99例有一次囊胚移植失败史，36 例有两次囊胚移植失败史，8 例有移植三次囊胚失败史，2 例有移植四次囊胚失败史。此组病人，虽然有囊胚移植一次或多次失败的病史，但总体妊娠率最高，各个年龄阶段的妊娠率均高于另外两组。可能原因是此组病人有可用囊胚形成，表明总体胚胎的发育潜能较高，即使冻存的卵裂期胚胎没有经过囊胚培养筛选［12］。对于这些移植囊胚未能成功妊娠，而移植解冻卵裂期胚胎获得临床妊娠的病人，影响妊娠的主要因素可能是子宫内膜与胚胎发育不同步。因此，当有反复囊胚移植失败时，解冻移植卵裂期胚胎可以增加胚胎种植的机会。本组病人中，回归分析显示年龄、获卵数、D3 优胚数、可用囊胚数及移植胚胎质量（是否移植优胚）不影响妊娠结局，而是否有剩余囊胚影响临床妊娠率（表4）。我们认为，在总体胚胎质量都很好的情况下，剩余囊胚数更多提示更少的囊胚移植失败次数，内膜条件更好，胚胎质量可能更好，因此临床妊娠率更高，尚需在后续的研究中进一步具体分析。另外，ICSI 病人的妊娠率有增加的趋势，可能在胚胎质量较好的情况下，ICSI 病人女方因素更少，内膜接受性更好。

辅助生殖技术的最终目标是获得单胎、足月、健康活产婴儿。双胎妊娠属于高危妊娠，可增加孕产妇妊娠期糖尿病、高血压等并发症，造成新生儿生长受限、早产、低出生体质量等风险［13-17］。本中心的解冻卵裂胚多胎率为24.6%（139/565），略低于中华医学会生殖医学分会2018 年上报的新鲜与解冻周期双胎率（新鲜周期28.64%；解冻周期26.9%）［18］，可能与我们选择冻存的卵裂期胚胎质量有关（1 枚优胚+1 枚质量中等的胚胎）。虽然现阶段单卵裂期胚胎移植在临床实施上仍有一定阻力［19］，我们已经开始在年轻病人中开始行单卵裂期胚胎移植，降低卵裂期胚胎移植的多胎妊娠率，保证母婴安全。

总之，我们的结果显示，D3 冷冻卵裂胚移植的临床妊娠率显著低于常规的解冻单囊胚移植。但是，在养囊的基础上冻存部分卵裂期胚胎，保证患者有胚胎移植，尤其对于养囊失败的患者，即使体外培养没有囊胚形成，移植冻存的卵裂期胚胎也有一定的临床妊娠机会。对于反复解冻囊胚移植失败的患者，移植卵裂期胚胎也可获得较高的临床妊娠率。因此，在目前养囊为主流的情况下，对于不同情况的患者在D3冻存少数卵裂期胚胎均可增加胚胎移植及妊娠的机会，是临床开展囊胚培养、囊胚移植方案的有力补充及保障。