基于网络药理学方法分析股骨头坏死愈胶囊治疗股骨头坏死的潜在靶点及作用机制

张雪，徐彬，刘又文，李无阴，张虹，岳辰

(1.河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 洛阳 471002；2.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012)

股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)属中医学“骨蚀”范畴[1]。中医学理论认为，肾虚、血瘀是ONFH的基本证候，而补肾活血法则是中医治疗ONFH最主要的治则之一[2]。基于补肾活血法组方的股骨头坏死愈胶囊是传承两百余年的平乐郭氏正骨治疗“骨蚀”的经典方剂。前期的临床研究显示，股骨头坏死愈胶囊能有效改善ONFH患者的髋关节功能，延缓病情进展[3]。相关的动物实验也表明，该药能够提高激素性ONFH兔血清骨钙素与降钙素水平[4]。

股骨头坏死愈胶囊的组成药物较多，明确其治疗ONFH的靶点及作用机制较为困难。网络药理学方法是基于系统生物学理论，根据成分、疾病、靶点之间相互作用的系统研究方法，通过高通量组学数据分析、虚拟计算及网络数据库检索，对生物系统进行网络分析，具有整体性、系统性等特点，已广泛应用于药物活性成分筛选、药物作用机制及疾病发病机制研究等方面[5]。因此，本研究基于网络药理学方法分析了股骨头坏死愈胶囊治疗ONFH的潜在靶点及作用机制，现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物有效成分及靶点筛选分别在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中医药百科全书(encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)数据库中检索股骨头坏死愈胶囊主要组成药物“鹿茸”“续断”“杜仲”“丹参”“鸡血藤”“黄芪”的活性成分(设定口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18)和靶点。剔除重复活性成分和靶点后,在UniProt数据库中将靶点蛋白名称转换为规范的基因名称，并剔除无靶点活性成分。将从TCMSP与ETCM数据库筛选获得的活性成分和靶点信息取并集，得到股骨头坏死愈胶囊的有效成分和靶点信息。

1.2 关键靶点筛选在GeneCards数据库中以“osteonecrosis of femoral head”为关键词进行检索，获得ONFH相关基因。同时从GEO数据库下载包含ONFH基因数据的GSE74089数据集，通过R软件Limma包进行差异基因分析(筛选标准为FDR<0.05、logFC>1)得到ONFH差异表达基因。将上述ONFH相关基因、ONFH差异表达基因及1.1中获得的药物靶点基因输入Venny2.1.0在线作图网站绘制韦恩图，将获得的交集基因作为股骨头坏死愈胶囊治疗ONFH的关键靶点。

1.3 药物-成分-靶点蛋白互作网络构建将1.1筛选出的有效成分和1.2筛选出的关键靶点基因名称输入到STRING数据库(Version11.0)中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，构建药物-成分-靶点蛋白互作网络，将蛋白互作网络图导入Cytoscape3.6.1软件进行分析，剔除孤立有效成分和孤立靶点。

1.4 关键靶点基因功能及信号通路富集分析使用R软件的ClusterProfiler包对1.2筛选出的关键靶点基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，挖掘关键靶点的生物学功能和通路信息。

1.5 核心靶点筛选将1.2筛选出的关键靶点基因名称输入到STRING数据库(Version11.0)构建关键靶点蛋白互作网络，并将关键靶点蛋白互作网络图导入Cytoscape3.6.1软件分析网络图中的关键节点及度值，筛选其中具有最高度值的靶点作为核心靶点。

2 结 果

2.1 药物有效成分及靶点筛选结果在TCMSP中筛选到活性成分121个、靶点243个，在ETCM数据库中筛选到活性成分95个、靶点405个。将2个数据库中筛选到的活性成分和靶点分别取并集后获得股骨头坏死愈胶囊的有效成分203个(鹿茸有效成分2个、续断有效成分6个、杜仲有效成分153个、丹参有效成分86个、鸡血藤有效成分92个、黄芪有效成分134个)，靶点592个。

2.2 关键靶点筛选结果在GeneCards数据库中检索到ONFH相关基因2033个，在GEO数据库GSE74089数据集获得ONFH差异表达基因8178个(上调基因5061个、下调基因3117个)(图1)。将ONFH相关基因、ONFH差异表达基因及药物靶点基因取交集后，获得股骨头坏死愈胶囊治疗ONFH的关键靶点57个(图2)。

2.3 药物-成分-靶点蛋白互作网络构建结果构建的药物-成分-靶点蛋白互作网路包含200个节点和500条边，蛋白互作网络显示137个药物有效成分与57个关键靶点有对应关系(图3)。

2.4 关键靶点基因功能及信号通路富集分析结果GO功能富集分析生物学过程、细胞组分及分子功能目录下前10位的富集分析结果见图4，主要涉及激素反应(类固醇激素、糖皮质激素、肽激素及激素的分泌和运输)，氧供反应(氧气水平、缺氧和氧气水平降低)，免疫系统过程调节(炎症反应、白细胞迁移、T细胞活化及白细胞-细胞粘附调节)，骨细胞调节(分化、骨化、稳态、迁移)，骨小梁形成，骨重塑调节，骨化调节，软骨发育，骨合成过程等。KEGG信号通路富集分析排名前10位的富集结果见图5，主要包括缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信号通路、核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路、鞘脂信号通路、p53信号通路、钙信号通路、精氨酸和脯氨酸代谢信号通路。

2.5 核心靶点筛选结果以筛选出的57个关键靶点构建的蛋白互作网络图显示，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)为具有最高度值的关键靶点，即核心靶点(图6)。

3 讨 论

中医学理论认为肾藏精，主骨生髓，为先天之本。骨骼的生长发育、盛衰强弱均与肾精充盈与否有关，肾精充盈则骨有所养、骨骼强健，肾精亏虚则骨失所养、髓不实而骨不坚，因此肾精充盈是保证骨骼健康的重要条件。肝肾同源，肝藏血，肾水亏虚不能滋养肝木，又会形成血虚、血瘀，血液不能发挥其濡养作用，从而诱发骨蚀。因此，尽管历代医家对于骨蚀的辨证论治并不完全统一，但均认为肾虚、血瘀是其基本证候，补肾活血法为其主要治则之一。股骨头坏死愈胶囊中，鹿茸温肾壮阳，丹参活血化瘀，二者共为君药；续断、杜仲合用补肝肾、强筋骨、行血脉、助鹿茸补肾壮骨兼活血，黄芪益气行血，鸡血藤行血补血，四药共为臣药。诸药合用，共奏温补肾阳、活血祛瘀止痛之效。

图1 GEO数据库筛选出的股骨头坏死差异表达基因火山图和表达量热图

图2 股骨头坏死愈胶囊治疗股骨头坏死关键靶点筛选韦恩图

关键靶点基因GO功能富集分析及KEGG通路富集分析结果显示，股骨头坏死愈胶囊治疗ONFH的分子生物学机制主要涉及HIF-1、NF-κB、p53等信号通路，参与激素反应、氧供反应，免疫系统过程调节、骨细胞调节、骨小梁形成、骨重塑调节、骨化调节、软骨发育、骨合成等生物学过程。已有研究表明，补肾活血药物可通过HIF-1信号通路、NF-κB信号通路，p53信号通路治疗多种疾病，包括ONFH、骨关节炎及脊柱退变[6]。HIF-1α是恢复细胞内氧浓度的关键调节因子，在调节干细胞血管生成中起关键作用[7]，也被证实参与了早期ONFH的发生发展[8]。HIF-1α信号通路被证实参与骨细胞和成骨细胞的形态和功能调节[9]。Wu等[10]发现，桃红四物汤可以促进家兔股骨头组织中HIF-1α及血管内皮生长因子的表达，抑制细胞凋亡，从而延缓ONFH。NF-κB是炎症反应的主要介质，通过参与细胞因子释放，与许多骨科疾病的发生有密切联系[11]。Qu等[12]在ONFH患者的变性软骨和经卵泡抑素样蛋白1处理的软骨细胞中检测到NF-κB信号通路激活。Pei等[13]发现，Toll样受体4/NF-κB的过度激活可能交互式地抑制Wnt/β-catenin信号通路并诱发ONFH，并提出NF-κB可以作为ONFH的治疗靶点。Zhang等[14]研究发现，氧化应激可以提高骨髓间充质干细胞表达p53，而抑制p53表达可以显著增强线粒体自噬，抵抗骨髓间充质干细胞的凋亡和衰老，并有效提高骨髓间充质干细胞对早期激素诱导的ONFH的修复作用。结合本研究的结果，我们认为股骨头坏死愈胶囊的有效成分通过57个关键靶点，参与氧供反应、激素反应、细胞凋亡、免疫调节、骨代谢等生物学过程，进而对ONFH发挥治疗作用。

图3 构建的药物-成分-靶点蛋白互作网络图

图4 股骨头坏死愈胶囊治疗股骨头坏死关键靶点基因GO功能富集分析结果气泡图

图5 股骨头坏死愈胶囊治疗股骨头坏死关键靶点基因KEGG信号通路富集分析结果气泡图

图6 股骨头坏死愈胶囊治疗股骨头坏死关键靶点蛋白互作网络图

筛选出的57个关键靶点的蛋白互作网络显示，TNF是具有最高度值的核心靶点。作为重要的炎症因子，TNF与成骨细胞分化、成熟密切相关[15-16]，参与ONFH的发生发展[17-18]。Li等[19]的研究表明，在ONFH患者的软骨退变过程中，TNF通过NF-κB信号通路上调了解聚蛋白样金属蛋白酶-7的表达，而后者可使软骨退变加重。Peng等[20]的研究表明，移植碱性成纤维细胞生长因子-2基因转染的间充质干细胞和异种抗原-松质骨，可以抑制TNF表达，促进ONFH的修复。Qu等[12]发现，卵泡抑素样蛋白1在ONFH患者关节滑膜及软骨组织中表达增加，并且可以增加ONFH模型中TNF的表达。

本研究的结果显示，股骨头坏死愈胶囊治疗ONFH的潜在靶点为TNF，其作用机制可能为通过HIF-1、NF-κB、p53等信号通路，参与激素反应、氧供反应、免疫系统过程调节及骨形成调节等生物学过程。