女贞子中5种环烯醚萜苷类成分的降解动力学研究*

刘媚琪 ，邱紫莹，王冬萍 ，任晓亮 ，王萌 ，孙立丽

（1.天津中医药大学中药学院，天津 301617；2.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 301617）

女贞子为木犀科植物女贞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果实，味甘、苦，性凉，主要含有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、三萜类、黄酮类、蒽醌类、多糖类以及挥发油等化学成分[1-2]，现代药理研究表明女贞子或其提取物具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗骨质疏松以及降糖、降脂等药理作用[3-5]。其用药历史悠久，是常见的补气疏肝、滋阴补肾中药。女贞子是出自《扶寿精方》的经典名方二至丸中的药材之一[6]，用于治疗或缓解视力模糊、须发早白、大便郁结、骨质疏松、腰膝酸软等症状[7-10]。含有女贞子的中成药很多，临床上应用广泛，且涵盖多种剂型，如片剂、丸剂、颗粒剂等[11]，由于其缓解防治的用药特点以及滋养肝肾、益精补虚的药用功效，患者可能需要很长一段时间服用该药，而患者长时间存放或者携带过程中很可能受环境因素影响而使其有效成分发生降解甚至影响药效。

课题组前期研究发现含有女贞子的成方制剂二至丸中部分药效成分容易受到物理或化学环境的影响而发生降解[12]。环烯醚萜苷类成分是女贞子的主要活性成分之一，具有多种药理活性，但由于其中含有酯键和糖苷键等结构，性质并不稳定，易于发生水解，这是否会影响女贞子的质量及药效尚不可知，而且此类成分在女贞子中含量较高，但是目前对此类成分稳定性的研究尚未见报道。

本研究采用化学反应动力学方法系统研究了女贞子中5种环烯醚萜苷类成分在多种物理、化学环境下的降解规律，预期为女贞子药材以及含女贞子的药物制剂的储存、应用及开发提供科学依据。

1 材料

1.1 实验仪器 Acquity H-class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；DELTA 320 pH仪（瑞士Mettler Toledo公司）；X224ZH十万分之一天平（奥豪斯仪器有限公司）；AHH-2数显恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司）。

1.2 药品和试剂 橄榄苦苷对照品（纯度＞98%，批号CHB180620，成都克洛玛生物科技有限公司）；木樨榄苷-11-甲酯对照品（纯度＞98%，批号YL2012121，上海一林生物科技有限公司）；女贞酸对照品（纯度＞98%，批号YL2014062102，上海一林生物科技有限公司）；女贞苷G13对照品（纯度＞98%，批号YL2014062501，上海一林生物科技有限公司）；特女贞苷对照品（纯度97.3%，批号111926，中国食品药品检定研究院）；甲酸（色谱纯，美国ROE SCIENTIFICINC）；乙腈、甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；盐酸（分析纯，天津化学试剂一厂）；3% H2O2（分析纯，河北吉捷生物科技有限公司）；氢氧化钠、氯化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；氯化铁、氯化亚铁（分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司）。

2 方法和结果

2.1 溶液制备 精密称取橄榄苦苷、女贞酸、女贞苷G13、特女贞苷和木樨榄苷-11-甲酯对照品各5.00 mg，用无水甲醇定容于5 mL棕色量瓶中，得到质量浓度为1.00 mg/mL的对照品储备液，避光放于4℃冰箱保存。

2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相 A：0.1%甲酸水，流动相 B：乙腈；梯度洗脱（0～5 min，5%～15%B；5～15 min，15%～17%B；15～30 min，17%～34%B）；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL。

2.3 温度对稳定性的影响

2.3.1 温度稳定性实验 分别量取“2.1”项下实验方法配制的5种环烯醚萜苷成分样品溶液200 μL并分别置于10 mL棕色量瓶中，用纯水定容至刻度后，并置于不同温度（37、60、80℃）环境下，得到不同温度条件下的样品溶液，分别进行超高液相色谱（UPLC）分析样品溶液中对照品的初始浓度（C0）和不同时间的剩余浓度（Ct），结果根据动力学规律，以百分剩余浓度的对数[ln（Ct/C0）]对时间（t）进行线性拟合，绘制降解动力学曲线，计算5种活性成分在不同温度下的降解速率常数k，并根据Arrhenius公式，以lnk对-1/T作图（图2），计算各成分的降解活化能Ea（公式1）。计算得到的5种环烯醚萜苷类活性成分在不同温度下的降解速率方程、拟合系数、半衰期t0.5等相关参数见表1。

表1 女贞子中5种环烯醚萜苷类成分在不同温度下降解参数

其中k为反应速率常数，A为指数前因子，Ea为活化能（J/mol），R为摩尔气体常数（8.314 J/K/mol），T 为热力学温度（K）。

2.3.2 温度稳定性结果 表1结果显示5种单体降解规律均符合一级动力学过程，5种成分在25℃下的活化能均大于40 kJ/mol，表明5种环烯醚萜苷类成分在常温下不易发生化学反应；且5种单体随着温度上升其降解速率常数k随之增大，说明5种单体随温度升高其降解速率均明显加快，可见各单体成分降解速率均受温度影响，降解速率随温度升高明显加大；由降解动力学曲线（图1）可以更直观地看出各单体随温度升高降解速率均明显加快。

图1 各单体成分在不同温度下降解动力学曲线

2.4 pH对稳定性影响

2.4.1 pH稳定性实验 分别量取“2.1”项下实验方法配制的5种环烯醚萜苷成分样品溶液200 μL于10 mL棕色量瓶中，并用配好的不同pH（3.0、5.0、6.2、8.0）溶液定容，得到不同pH条件下的样品溶液，分别进行UPLC分析样品溶液中对照品的初始浓度（C0）和不同时间的剩余浓度（Ct），结果根据动力学规律，以[ln（Ct/C0）]对时间（t）进行线性拟合，并分别绘制降解动力学曲线，如图3所示，计算得到的5种环烯醚萜苷类活性成分在不同pH下的降解速率方程、拟合系数、半衰期t0.5等相关参数见表2。

表2 女贞子中5种环烯醚萜苷类成分在不同pH下降解参数

2.4.2 pH稳定性结果 由降解动力学曲线可看出，橄榄苦苷、木樨榄苷-11-甲酯、女贞苷G13、特女贞苷在强酸性和碱性的环境下均不如弱酸性或接近于中性条件下稳定，橄榄苦苷、女贞苷G13和特女贞苷半衰期在pH为5.0时最大，木樨榄苷-11-甲酯在pH为6.2时半衰期最长，最稳定；而女贞酸在酸性条件下稳定，随pH增大其降解速率加快，其半衰期随pH增大而减小。

图2 各单体成分降解速率（lnk）与温度（1/T）关系图

图3 各单体成分在不同pH下降解动力学曲线

2.5 光照对稳定性的影响

2.5.1 光照稳定性实验 精密量取“2.1”项下实验方法配制的5种环烯醚萜苷成分样品溶液200 μL分别置于10 mL棕色量瓶中，用纯水定容至刻度后，并将其分别置于黑暗避光、紫外灯（8.16×105lux）及日光灯（1.55×106lux）环境下，得到不同光照条件下的样品溶液，分别进行UPLC分析，分析结果根据动力学规律，以[ln（Ct/C0）]对时间（t）进行线性拟合，并绘制降解动力学曲线，如图4所示，并计算得到的5种环烯醚萜苷类活性成分在不同光照下的降解速率方程、拟合系数、半衰期t0.5等相关参数见表3。

表3 各单体成分在不同光照条件下的降解参数

2.5.2 光照稳定性结果 由图4以及表3可以看出与避光黑暗相比，5种成分在日光灯和紫外灯照射下半衰期均缩短，说明紫外灯和日光灯均会不同程度的加速5种单体成分的降解，其中紫外灯对橄榄苦苷、女贞苷G13和特女贞苷的降解影响强于日光灯；而女贞酸和木樨榄苷-11-甲酯则对日光灯更为敏感，降解更为明显。

图4 各单体成分在不同光照环境中降解曲线

2.6 金属离子对稳定性影响

2.6.1 金属离子稳定性实验 分别取“2.1”项下实验方法配制5种环烯醚萜苷成分样品溶液取200 μL分别置于10 mL棕色量瓶中，分别用超纯水、0.10 mol/L Fe3+、Fe2+和 Na+的水溶液定容，得到不同离子环境下的样品溶液，分别进行UPLC分析，以[ln（Ct/C0）]对时间（t）进行线性拟合，并分别绘制降解动力学曲线，如图5所示，并计算得到的5种环烯醚萜苷类活性成分在不同金属离子下的降解速率方程、拟合系数、半衰期t0.5等相关参数见表4。

图5 各单体成分在不同金属离子环境中降解曲线

2.6.2 金属离子稳定性结果 由图5以及表4可看出，5种成分在金属离子环境中均会加快其降解，与水溶液相比，金属离子环境下其半衰期明显缩短，3种金属离子对5种成分降解速率的影响程度均为 Fe3+＞Fe2+＞Na+。在 Fe3+环境下各成分降解速率变化明显，各化合物降解半衰期均小于5 min，对5种化合物的稳定性影响显著。

表4 各单体在不同金属离子环境下的降解参数

3 结论与讨论

环烯醚萜是萜类化合物中的单萜类成分，为蚁臭二醛的缩醛衍生物，其半缩醛结构不稳定，易水解或在酸性介质中发生重排。实验结果表明，5种环烯醚萜苷类成分中稳定性受碱性条件影响较酸性条件更为明显，特女贞苷、女贞苷G13、木樨榄苷-11-甲酯、橄榄苦苷均在中性条件下最稳定，碱性和酸性条件下有不同程度的降解；猜测女贞酸可能因其含有羧基的结构与其显酸性的特质，其在酸性条件下稳定，在碱性条件下极易降解，随pH增高降解速率加快；5种环烯醚萜苷类成分降解速率均不具备高温稳定性，对温度敏感，其降解速率均随温度升高而加快；与黑暗避光相比，紫外灯和日光灯长时间照射均会不同程度地加速5种环烯醚萜苷类成分的降解，其中橄榄苦苷在日光灯和紫外灯下降解均较快，猜测是其结构含有易断裂的酯键和醚键吸收特定波长的光后发生断裂所致；金属离子对5种成分稳定性也均有影响，对5种成分降解速率影响程度 Fe3+＞Fe2+＞Na+。

本研究采用化学反应动力学方法系统研究了女贞子中5种环烯醚萜苷类成分在多种物理、化学环境下的降解规律，提示了此类药材或制剂应在低温、pH近中性环境储存，且应避免用铁器储存，避免紫外灯和日光灯长时间照射，并控制溶剂中存在的金属离子。本研究为女贞子中环烯醚萜苷类成分在体内的稳定性、药代动力学和相关制剂研究提供了一定的实验依据，但其降解是否会对女贞子以及成方制剂药效产生影响还需进一步研究。