碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌检测及鉴定现状

雷静 刘泽世 高兴辉 汤一苇★ 耿燕★

碳青霉烯类抗菌药物具有抗菌谱广、对大多数β⁃内酰胺酶稳定、不易被水解、不良反应相对较少的特点，是有效治疗革兰阴性杆菌严重感染的抗菌药物之一。然而，在抗生素滥用问题日益严峻的今天，碳青霉烯类抗菌药物也无法避免出现耐药危机，碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌（carbap⁃enem⁃resistant Enterobacterales，CRE）的出现，无疑使临床抗感染治疗陷于无药可用的境地［1］。CRE耐药问题不容小觑，尤其是产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌（carbapenemase⁃producing Enterobacterales，CPE），早期快速、准确地检测CPE 是遏制其传播的关键，也有助于精准用药治疗［2］。

1 CRE 定义

美国疾病预防与控制中心（centers for disease control and prevent，CDC）将CRE 定义为满足以下任一条件：①肠杆菌目细菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南或多利培南任何一种碳青霉烯类抗菌药物耐药；对亚胺培南天然敏感性降低的细菌（如摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等），需参考除亚胺培南外的其他碳青霉烯类抗菌药物的药敏结果；②产碳青霉烯酶［3］。

2 CRE 耐药机制

产碳青霉烯酶是CRE 耐药最主要的机制，其余耐药机制还包括外膜孔蛋白缺失或突变协同AmpC 酶或超广谱β⁃内酰胺酶的表达、外排泵系统过度表达［4⁃5］。根据Ambler 分子分类方法，可将碳青霉烯酶分为A、B 和D 三类。见表1。

表1 碳青霉烯酶分类Table 1 classification of carbapenemases

3 CRE 表型检测方法

3.1 Carba NP 试验

Carba NP 试验是2015年CLSI 推荐的对CPE和产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的一种检测方法，其原理为碳青霉烯酶水解亚胺培南后导致溶液PH值改变而发生颜色变化。据报道，Carba NP 试验检测肠杆菌目细菌和铜绿假单胞菌产KPC、NDM、VIM、IMP 等碳青霉烯酶的灵敏度和特异度均>90%，但由于OXA⁃48 对碳青霉烯类药物活性较弱，导致其结果具有较高的假阴性。因此，Carba NP 试验在OXA⁃48 高流行区域（如土耳其和其他中东地区等）不具备检测优势［6⁃7］。另外，进行Car⁃ba NP 试验应选用非选择性培养基进行菌株培养。研究表明，从麦康凯和显色培养基获取的菌株在检测VIM 或OXA⁃48 存在假阴性，而使用MH 平板时，当菌株同时携带OXA⁃48 和NDM/VIM 时，结果存在假阴性［8⁃9］。

3.2 改良碳青霉烯酶灭活试验

2017年，CLSI 推荐改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）用于检测CPE。2018年，增加了EDTA 改良碳青霉烯灭活试验（EDTA⁃modified carbapenemase in⁃activation method，eCIM），根据碳青霉烯酶可水解美罗培南以及EDTA 可抑制金属β⁃内酰胺酶活性的原理，可区分细菌产酶类型。研究表明，mCIM检测CPE 的灵敏度和特异度均为100%；eCIM 区分丝氨酸酶的灵敏度和特异度分别为100%、95.1%，MBLs 的灵敏度和特异度为98.4%和100%，若待测菌株同时存在丝氨酸酶和MBLs，eCIM 试验结果将出现误差［10⁃12］。

3.3 碳青霉烯酶抑制剂增强试验

根据3⁃氨基苯硼酸和乙二胺四乙酸可分别抑制丝氨酸酶和金属β⁃内酰胺酶活性的原理，可判断待测菌株产酶类型，但无法检测OXA 酶［13］。研究显示，碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测单一酶型菌株的灵敏度为100%，特异度>98.8%，检测同时产丝氨酸酶和MBLs 的灵敏度为96.8%，特异度为100%［14］。

3.4 质谱技术

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix⁃assisted laser desorption ionization time⁃of⁃flight mass spectrometry，MALDI⁃TOF MS）是近年来快速发展起来的一种检测生物大分子的重要手段，被认为是快速鉴定临床微生物的新利器，通过测定蛋白特征峰或碳青霉烯类药物结构的完整性检测酶的存在。结合目前研究结果，MALDI⁃TOF MS 技术检测KPC 酶的灵敏度和特异度分别为85.1%和100%［15⁃16］。目前MALDI⁃TOF MS 在此方面的研究存在异质性且无统一标准化的操作方法，进行酶水解法时某些抗菌药物溶液需自配，并需与待测菌共孵育1～2.5 h，且不同酶型孵育时间不同。

3.5 显色培养基

显色培养基已广泛应用于临床微生物的鉴别诊断，其原理为目标细菌产生的特异性酶作用于底物而长成有色菌落，由于添加抗菌药物或其他抑制剂，非目标性细菌生长受限，可从样本中直接分离出CRE。近年来，不同厂家研发了不同CRE商品化产品，如Brilliance CRE、bioMérieux chromID Carba、CHROMagar Colorex KPC 等。两项研究表明，与PCR 相比，以上3 种显色培养基的灵敏度分别为77.6%～78.0%、89.8%～91.0%和56.0%～83.7%，特异度分别为60.0%～87.1%、76.0%～95.0%和70.0～92.1%，但其对OXA⁃48 的检测能力有待提高［17⁃18］。此外，一些产中间型碳青霉烯酶（NDM⁃1）菌株可能生长不良［19］。CRE 表型检测方法。见表2。

表2 CRE 表型检测方法Table 2 CRE phenotypic testing methods

4 碳青霉烯酶基因型检测

碳青霉烯酶基因型检测是检测能够编码碳青霉烯酶的DNA 序列。其主要检测方法包括靶向基因检测和二代测序。与表型方法相比，基因型方法的优势是能够检测并明确碳青霉烯酶基因型，检测速度快，节省时间；劣势是技术要求高，不能确定基因是否表达，检测成本高。见表3。

表3 CRE 耐药基因检测方法Table 3 CRE resistance genotype detection methods

4.1 酶免疫层析技术

酶免疫层析技术是一种以抗原抗体反应为基础，用于体外快速检测阳性血培养物以及纯菌落中碳青霉烯酶。近年来，不同厂家基于此技术推出不同的试剂盒，如NG⁃Test CARBA 5、RESIST⁃4 O.K.N.V.和免疫显色试剂，可对blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP（RESIST⁃4 O.K.N.V.不能检测）和blaOXA⁃48进行检测。研究显示，酶免疫层析技术检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度均>92.0%，但当细菌携带2 种或以上的酶型后，酶免疫层析方法只能检测到部分酶型从而产生重大错误［20⁃21］。

4.2 Carba⁃R Assay

Carba⁃R Assay 是一种荧光定量PCR 检测方法，可在50 min 内检测直肠拭子、尿液和纯菌落中5 种碳青霉烯酶。一项多中心研究发现，在直肠拭子和临床菌株中，与测序结果相比，Carba⁃R 检测碳青霉烯酶基因的总阳性符合率分别为96.0%和99.7%，总阴性符合率分别为94.0%和98.0%［22］。此外，在301 份痰标本中，Carba⁃R Assay 与PCR 方法相比，其阳性一致率和阴性一致率分别为92.9%和86.7%［23］。而检测血流感染菌株和阳性血培养物时，Carba⁃R 特异度为100%，NG⁃Test CARBA5和Carba⁃R 检测菌株的灵敏度分别为92.1%和100.0%，阳性血培养物的灵敏度分别为79.3%和100%［20］。应用Carba⁃R 对CPE 定植患者进行快速筛查，可将CPE 的定植率从28.6%降至5.6%，感染率从35.7%降至2.8%，有效地限制了其在医疗环境中传播［24］。

4.3 BDMAX

BD MAX 是一种单试剂、即用、全自动的多重实时PCR 体外诊断产品，能够检测菌株和直肠拭子中的blaKPC、blaNDM、blaVIM/blaIMP和blaOXA⁃48基因。一项研究结果显示，BD MAX 检测碳青霉烯酶的灵敏度和特异度可达97.1%和98.8%，但不能检测到IMP⁃11、IMP⁃13、IMP⁃14 和OXA⁃535 突变体，而在直肠拭子标本中，其灵敏度和特异度分别为92.8%和97.8%［25］。由于VIM 和IMP 之间缺乏区分，可能会限制BD MAX 在这些酶广泛流行的地区应用。

4.4 LightMix Modular Carbapenemases Kits

LightMix Modular Carbapenemases Kits 是一种多重PCR 方法，可根据需求选择检测靶标数量，操作时间约5 min，90 min 内报告结果。与测序结果相比，其对118 份临床分离株的总体敏感性和特异性分别为99%和100%，且在CPE 定植患者中，Light⁃Mix Modular Carbapenemases Kits 与Xpert Carba⁃R检测结果一致［26］。

4.5 ePlex BCID⁃GN panel

ePlex BCID⁃GN panel 是一种采用电润湿和电子传感器技术对血培养阳性瓶进行提取、扩增和竞争性DNA 杂交，可鉴定56 种细菌和真菌以及包括碳青霉烯酶在内的β⁃内酰胺酶检测试剂盒。研究显示，BCID⁃GN panel 对碳青霉烯酶的PPA 和NPA 分别为98.1%和99.9%［27］。

4.6 Verigene Gram⁃negative blood culture test

Verigene Gram⁃negative blood culture test 是一种非扩增方法，其依赖于从阳性血培养物中提取核酸，然后使用捕获和检测探针进行基于微阵列的检测。一项多中心研究表明，Verigene 与参考方法相比，对5 种碳青霉烯酶基因的阳性一致率>94.3%，阴性一致率>99.9%［28］。若阳性血培养物中为混合菌，Verigene 则无法确定耐药基因与特定细菌之间的关联［29］。

4.7 FilmArray BCID2

FilmArrayBloodCultureIdentification2（BCID2）采用巢式多重PCR 技术，可在1 h 内检测包括blaKPC、blaIMP、blaNDM、blaOXA⁃48⁃like、blaVIM在内的10 种耐药基因［30］。一项研究显示BCID2 鉴定微生物种类的灵敏度和特异度分别为98.8%和99.9%，检测耐药基因的灵敏度和特异度均为100%［31］。然而，在FilmArray 上进行测试的成本超过100 美元，这限制了该方法在低中度流行环境下检测blaKPC的实用性。

4.8 二代测序

全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）被认为是检测碳青霉烯酶基因的最全面的分子检测方法，它还可测定除碳青霉烯酶外的其他耐药基因。在过去十年中，WGS 的成本急剧下降，在临床微生物学实验室中的应用已指日可待。然而，在将该技术纳入常规临床微生物学之前，还需要克服一些障碍，包括周转时间长和数据管理困难。宏基因组测序与WGS 类似，但它是直接从临床样本（如痰）中获得DNA，由于数据分析的高成本和复杂性，目前还不足以对感染进行评估。

5 质控菌株选择

进行以上碳青霉烯酶实验室检测时，应同时测试相应的阳性和阴性质控菌株。首选的阳性质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA⁃1705（产KPC 型碳青霉烯酶）、肺炎克雷伯菌ATCC BAA⁃2146（产NDM 型金属β⁃内酰胺酶）和肺炎克雷伯菌ATCC BAA⁃2524（产OXA⁃48 型碳青霉烯酶），首选的阴性质控菌株为肺炎克雷伯菌BAA⁃1706（不产碳青霉烯酶）。若实验室不具备上述首选质控菌株，可选择经DNA 测序后相应已明确的碳青霉烯酶基因型作为阳性质控菌株，而阴性质控菌株可选择大肠埃希菌ATCC 25922［13］。

6 小结和展望

目前实验室的CRE 表型检测方法，灵敏度较高、操作方便、价格较低，但存在特异度较低、缺乏标准化、耗时较长等缺点，限制了其进一步使用。随着CRE 基因型方法的出现，提高了检测的灵敏度和特异度，且操作简单，但也只能检测已知基因，不能检测未知基因。全基因测序方法弥补这个缺陷，能够检测已知和未知CRE 基因，这能够帮助临床解决疑难问题。

随着CRE 在包括中国在内的全球范围内不断地蔓延，一些菌株携带CRE 酶型种类和数量也在增加。未来的CRE 实验室检测方法和应用可能有下面一些趋势：第一是检测样本的类型会拓展，除了已应用的菌落、阳性血培养物以及肛拭子以外，呼吸道标本可能获得更多的应用。第二是在检测CRE 存在的前提下，迅速对其酶型进行判断，可用于临床指导治疗依据。第三是既往菌种鉴定基础上的耐药性检测有望被快速的CRE 酶型检测的“功能性”鉴定所取代。