水稻中5个FT-Like家族成员的基因编辑突变体的创建与分析

王 鑫，杨晓颖，田 瑶，周诗晨，兰志鹏，王馨翊，胡又川，梁闪闪，张泗举，栾维江

（1.天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

水稻育种中，传统育种方式和随机突变方式均存在费时、费力、周期长等局限性.近年来，随着基因编辑技术的产生及其在农业生产中展现出的巨大应用潜力，该技术在水稻育种中也得到了广泛应用[1-2].基因编辑技术能够对特定基因或基因特定位点进行敲除、定点插入及替换[3]，导致基因发生突变，从而影响基因功能及生物学性状.其中，第3代的簇状规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas系统因具有结构简单、效率高、成本低的优点，迅速取代锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）技术，成为目前应用最广泛的基因编辑技术[4].CRISPR/Cas系统的发现源于Ishino等首次在大肠杆菌中发现的一段具有串联重复的特殊结构，之后多位科学家在不同物种中发现存在类似的重复结构[5]，将其命名为CRISPR序列.CRISPR/Cas系统是细菌中的一种获得性免疫机制，其适应性免疫过程分为3个阶段：外源DNA的获取、初级CRISPR RNA的成熟以及靶标干扰，最终实现识别和降解外源DNA[6-7].由于CRISPR/Cas系统的靶向切割作用能够实现对生物体内基因组的定向编辑，促进靶基因突变，实现高效率定点突变，因此该技术在基因功能分析及调控、基因治疗及作物改良等方面发挥着重要作用[8].科学家们已将CRISPR/Cas系统应用于拟南芥[9-11]、水稻[12-14]、烟草[15]、油菜[16]、玉米[17]、大豆[18]、番茄[19]等物种中，水稻中主要以单基因编辑为主[20-21].Cas9具有在同一个体中同时编辑多个位点的优势，可在特定区域内设计不同靶序列的多个sgRNA，将Cas9导向特定的对应位点，实现多基因编辑[22-23].CRISPR/Cas9多基因编辑技术已在多种植物中广泛应用，如拟南芥[24]、水稻[25-27]、大豆[28]、杨树[29]等.由于sgRNA对靶序列的结合能力不同，因此每个靶点的编辑率可能存在差异.如Zeng等[26]在高产且耐寒性水稻的研究中，利用CRISPR/Cas9技术对穗长OsPIN5b、粒级GS3和耐寒OsMYB30这3个基因共设计6个靶位点进行编辑，在最终获得的转基因株系T0代中，OsPIN5b-site1、OsPIN5b-site2、GS3-site1、GS3-site2、OsMYB30-site1和OsMYB30-site2的编辑率分别为53%、42%、66%、63%、63%和58%.CRISPR/Cas9还存在一定的脱靶率，例如Bao等[28]在对大豆植株的研究中，对其SPL9家族中的GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c和GmSPL9d基因同时编辑，共设计7个靶点，分析其后代的编辑类型时发现，第3个表达盒中GmSPL9a及GmSPL9b靶点和第4个表达盒中的GmSPL9d靶点均未发生基因编辑.

抽穗期是影响水稻产量的关键时期，成花素基因是决定水稻抽穗期的关键因子，隶属于水稻FT-like亚家族.该亚家族共有13个成员，除了OsFTL2（Heading date 3a，Hd3a）和OsFTL3（RICE FLOWERING LOCUS T1，RFT1）的精确功能有明确报道外[30]，其他基因的功能尚不清楚.因此，本研究采用CRISPR/Cas9技术对该亚家族中有高度同源性的OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7以及OsFTL11基因进行共编辑，创建五突突变体，为全面研究FT-like亚家族的功能提供材料.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究以粳稻（Oryza sativaspp.Japonica）品种中花11（Zhonghua11）为背景，获得CRISPR/Cas9转基因材料.

1.2 靶点的设计

FT-like家族成员OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7以及OsFTL11基因序列来自NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov），使用CRISPR-GE（http：//skl.scau.edu.cn/）网站辅助设计靶点.靶点片段大小为20 bp左右，选择GC含量在40%～60%之间、具有（N）20NGG结构特征的序列作为靶点.之后对选择的靶点进行BLAST序列比对，选择特异性高的靶点构建载体.按照上述筛选原则，所选择靶点的引物序列如表1所示.

表1 5个FT-like家族成员靶位点及引物序列Tab.1 Target sites and primer sequences of five FT-like members

1.3 CRISPR/Cas9载体的构建

根据靶点设计原则，将包含sgRNA和启动子U6a、U6b、U3的载体作为模板，用5个靶点的特异性引物进行PCR扩增，将不同的靶基因序列整合到对应基因的sgRNA表达盒中，将靶位点和sgRNA依次连接，构建成为U6a：：6T1-sgRNA、U6b：：5T1-sgRNA、U6b：：4T1-sgRNA、U6c：：7T1-sgRNA以及U3：：11T1-sgRNA，使用BsaI和DNA连接酶将U6a：：T1-sgRNA、U6b：：T2-sgRNA、U6b：：T3-sgRNA、U6c：：T4-sgRNA和U3：：T5-sgRNA与CRISPR/Cas9载体进行边切边连，最终将5个靶点装载到CRISPR/Cas9目标载体中.连接体系：1.5μL的10×CutSmart Buffer、1.5μL的10μmol/L ATP、3μL的CRISPR/Cas9载体、30 ng二轮产物、0.5μL的BsaI、0.5μL的T4 DNA ligase，ddH2O补至15μL.扩增程序为：37℃5 min，10℃5 min，20℃5 min，15个循环，37℃5 min.

1.4 水稻的遗传转化与组织培养

采用农杆菌介导的遗传转化方法[31]，将验证正确的重组载体电击转化到农杆菌EHA105中，然后侵染野生型粳稻品种中花11的愈伤组织，再进行筛选、分化、生根、炼苗等过程，得到相应的转化材料.将其幼苗移栽，生长健壮后进行表型观察.

1.5 转基因植株的分子检测及突变类型

待转化幼苗生长30 d后，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的方法提取水稻叶片基因组DNA.使用CRISPR/Cas9载体的抗性筛选标记特异性引物（hyg-F和hyg-R）进行分子检测.用OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11靶位点的检测引物（表2）对转基因阳性植株进行测序，并运用BioXM2.6软件和在线解码工具DSDecode分析其序列，鉴定突变类型.

表2 靶位点的检测引物序列Tab.2 Primer sequences of target sites detection

2 结果与分析

2.1 FT-like亚家族的基因结构与靶点设计

本研究运用MEGA软件，采用Neighbor Joining法构建水稻FT-like家族成员的系统进化树，结果如图1（a）所示.由图1（a）可以看出，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7和OsFTL11均属于FT-like亚家族的同一个分支，具有较高的同源性.此外，它们的基因结构相似，均含有4个外显子和3个内含子，且氨基酸的一致性达到82.49%，如图1（b）所示.推测这些成员的功能可能冗余，因此构建了5个基因的共编辑材料，以期进行功能研究.

图1 FT-like家族基因的系统发育树和氨基酸序列比对Fig.1 Phylogenetic tree and amino acid sequence alignment of FT-like family genes

2.2 CRISPR/Cas9载体构建

根据靶点设计的原则，在基因的外显子上设计靶位点.其中，OsFTL4、OsFTL7和OsFTL11的靶点均位于各自的第4个外显子上，OsFTL5和OsFTL6的靶点均位于各自的第1个外显子上，5个成员具体的基因结构和靶位点如图2所示.

图2 5个FT-like家族成员的基因结构与靶位点Fig.2 Gene structure and target loci of five FT-like members

将5个靶点分别连接到sgRNA表达盒中，最后组装到CRISPR/Cas9载体中，获得重组载体.通过菌落PCR验证获得的重组载体，发现扩增出了预期的目的片段，PCR鉴定结果如图3（a）所示.对重组载体进行酶切鉴定，确定得到了正确的目的条带，酶切鉴定结果如图3（b）所示.上述结果表明5个成员的靶点均已连入到目的载体中，之后将验证正确的重组载体质粒用于转化实验.

图3 5个FT-like家族成员的CRISPR/Cas9载体构建Fig.3 Construction of CRISPR/Cas9 vector for five FT-like members

2.3 CRISPR/Cas9转基因植株的获得以及编辑类型的分析

通过农杆菌介导的遗传转化，获得转基因阳性植株，通过种植获得T2代转基因植株.对T2代转基因植株进行分子检测以及测序分析，结果发现，编辑突变体的突变类型主要为osftl4osftl5osftl6三突变体（triple mutant，tm）、osftl4osftl5osftl6osftl11四突变体（quadruple mutant，qm）及osftl4osftl5osftl6osftl7osftl11五突变体（penta mutant，pm）.

tm突变体有2个等位突变（tm1和tm2）.tm1突变体中，OsFTL4基因在PAM区下游3 bp处插入1个A碱基，OsFTL5基因在PAM区前3 bp处插入1个T碱基，OsFTL6基因在PAM区前4 bp处插入1个T碱基，如图4（a）所示.tm2突变体中，OsFTL4基因在PAM区下游3 bp处插入1个A碱基，OsFTL5基因在PAM区前4 bp处缺失8个碱基且存在2处碱基替换（G-T、T-G），OsFTL6基因在PAM区前2 bp处缺失2个碱基，如图4（b）所示.

qm突变体有3个等位突变，分别为qm1、qm2和qm3.qm1中，OsFTL4基因在PAM区下游3 bp处插入1个A碱基，OsFTL5基因在PAM区前4 bp处缺失27个碱基，OsFTL6基因在PAM区前4 bp处插入1个T碱基，OsFTL11基因在PAM区前4 bp处缺失1个碱基，如图4（c）所示.qm2中，OsFTL4基因在PAM区下游3 bp处插入1个T碱基，OsFTL5基因在PAM区前4 bp处缺失47个碱基，OsFTL6基因在PAM区前发生1个碱基的替换且在PAM区前3 bp处缺失38个碱基并插入3个碱基，OsFTL11基因在PAM区前2 bp处缺失2个碱基，如图4（d）所示.qm3中，OsFTL4基因在PAM下游区3 bp处插入1个C碱基，OsFTL5基因在PAM区前5 bp处缺失44个碱基，OsFTL6基因在PAM区前2 bp处缺失3个碱基，OsFTL11基因在PAM区前3 bp处缺失3个碱基，如图4（e）所示.

pm突变体中，OsFTL4基因在PAM区下游3 bp处存在1个杂合编辑，一条链插入1个C碱基，另一条链插入1个A碱基，OsFTL5基因在PAM区前3 bp处缺失1个T碱基，OsFTL6基因在PAM区前2 bp处缺失3个碱基，OsFTL7基因在PAM区前12 bp处缺失10个碱基，OsFTL11基因在PAM区前2 bp处缺失2个碱基，如图4（f）所示.

图4 编辑突变体的测序分析Fig.4 Sequencing analysis of editing mutants

qm突变体中，OsFTL5基因有大片段缺失的突变类型，用3%的琼脂糖凝胶检测PCR产物，结果如图5所示.

图5 qm突变体中OsFTL5基因大片段缺失突变的PCR检测Fig.5 PCR detection of mutation with large deletion of OsFTL5 in qm mutants

20个突变植株中，有4株结果显示为44 bp的纯合缺失，片段大小为797 bp；有3株为杂合突变，2条链的片段大小分别是841 bp和797 bp，与测序结果一致.

2.4 突变体的氨基酸序列分析

对突变体的氨基酸序列进行分析，结果如图6所示.OsFTL4的氨基酸序列由于单碱基的插入，在tm、qm和pm突变体中都发生了氨基酸的移码，从第114个氨基酸开始移码，直到终止密码子.OsFTL5的氨基酸序列由于碱基的替换、插入及缺失，在tm、qm及pm突变体中都发生了氨基酸的移码，从第49个氨基酸开始移码，直到终止密码子，tm和pm突变体中因碱基发生变化造成翻译提前终止，产生了截短的蛋白，而qm突变体中因碱基的大片段缺失而造成氨基酸序列的缺失.OsFTL6的氨基酸序列因碱基的替换、插入及缺失等，在tm、qm及pm突变体中发生了氨基酸的移码，从第41个氨基酸开始移码，直到终止密码子.其中，在tm1、qm1、qm2突变体中，由于碱基的插入，造成翻译提前终止，产生了截短的蛋白；而tm2、qm3、pm因3个碱基的缺失而导致缺失1个氨基酸.OsFTL7的氨基酸序列因碱基的大片段缺失，在pm突变体中发生了氨基酸的移码，从第113个氨基酸开始移码，并出现了氨基酸的缺失，直到终止密码子.OsFTL11的氨基酸序列因碱基的替换、插入及缺失，在tm、qm和pm突变体中发生了氨基酸的移码，从第41个氨基酸开始移码，直到终止密码子.其中，在tm1、qm1、qm2突变体中，由于碱基的插入，造成翻译提前终止，产生了截短的蛋白；而tm2、qm3、pm因3个碱基的缺失而导致缺失1个氨基酸.

图6 tm、qm和pm突变体中氨基酸序列的分析Fig.6 Analysis of amino acid sequence in tm，qm and pm mutants

2.5 突变体的表型分析

对田间T2代转基因植株进行表型观察后发现，tm、qm、pm突变体都出现了叶片早衰的表型，主要表现为叶片卷曲及黄化.黄化从叶尖及叶片边缘开始向叶片中部蔓延，最后从叶尖开始干枯，如图7所示.tm、qm、pm突变体均出现叶片早衰症状，说明OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6、OsFTL7、OsFTL11这5个基因可能存在一定的冗余，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6的突变就可以导致叶片早衰表型.tm、qm、pm突变体中共编辑的基因为OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6，这3个成员中某一成员或者二个成员突变是否就可以引起叶片早衰的表型，还需要进一步产生这3个成员各自的单突变体及其相互的双突变体才能确定.

图7 野生型与突变型植株的表型Fig.7 Phenotypes of wild type and mutant plants

3 讨论

水稻抽穗期是影响产量的重要农艺性状.抽穗太早，植株营养生长不足，库源不能平衡；抽穗太晚，则容易导致植物遭受低温冷害.成花素是调控抽穗的关键因子，主要在叶片中合成，之后转运到顶端分生组织.成花素属于FT-like亚家族，该家族的13个成员中，OsFTL2/Hd3a和OsFTL3/RFT1分别在短日照和长日照条件下发挥成花转变作用[32].近年来研究发现，FTlike亚家族中有些成员也发挥着促进抽穗或者抑制抽穗的作用，如OsFTL10过量表达会促进水稻抽穗[33]，OsFTL12过量表达则会抑制水稻抽穗.此外，Wang等[34]研究发现，GmFT在大豆根瘤固氮过程中发挥着重要作用，表明FT-like家族的功能并不局限在开花期调控上.本研究采用CRISPR/Cas9技术对水稻中具有高度同源性的5个FT-like亚家族成员进行共编辑，并对突变体植株测序分析，得到osftl4osftl5osflt6三突变体、osftl4osftl5osflt6osftl11四突变体及osftl4osftl5osflt6osftl7osftl11五突变体，突变类型主要表现为碱基的插入和缺失.这些突变会导致氨基酸序列发生改变，进而影响基因功能.对突变体的农艺性状进行观察，发现突变体植株均出现了不同程度的早衰表型，推测这5个成员在功能上可能存在冗余，影响植物的生长发育，产生早衰现象，也可能这5个成员中某一个基因发生突变就可产生早衰表型.通过分析发现，tm、qm及pm突变体中，OsFTL4、OsFTL5、OsFTL6基因都发生了编辑，是否3个基因中的某个基因突变就会导致早衰表型，还需进一步创建单个基因编辑的突变体进行验证.综上所述，本研究为FT-like亚家族5个成员的基因功能的研究提供了实验材料，也为后续的农作物的抽穗期性状改良提供了基础及依据.