长白猪FGF21基因CDS 克隆及禁食后表达规律研究

李鑫月，郭振清，李婧实，李红强,2*

（1.河北科技师范学院海洋资源与环境学院，河北昌黎 066600；2.河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室（筹）,河北昌黎 066600）

脂质代谢是一个非常复杂的生物学过程，肌内脂肪含量是影响猪肉品质如嫩度、风味及多汁性的主要因素，受到多种功能基因调控。因此，筛选和鉴定与脂肪代谢相关的基因是猪遗传育种工作者的重要任务之一。成纤维细胞生长因子家族（Fibroblast Growth Factors，FGFs）各成员在葡萄糖和脂质代谢等多种生物学过程发挥重要作用，引起人们的极大关注。目前发现该家族有23个成员和18个相应的受体，FGFs 与其受体相互作用启动细胞内信号传导，广泛参与生理和病理多种生物学过程，如提高胰岛素的敏感性、降低空腹血糖水平、减轻体重、减少肝脏脂肪含量等。FGF21 是FGFs 家族成员之一，作为内分泌性生长因子在调节糖脂代谢方面发挥重要作用。高脂高糖饲料喂养FGF21 转基因小鼠能够抵抗体重增加和肥胖发生。在灵长类糖尿病模型中，使用FGF21 或FGF21类似物可以显著降低血糖、胰岛素水平和体重；在高脂小鼠模型中，给予FGF21 重组药可明显降低高脂小鼠的体重，阻止脂肪性肝病发生，最终使得各组织脂质含量和肝葡萄糖的含量降低。同样，敲除小鼠基因后，体内胰岛素敏感性下降，由此推测FGF21 可提高ob/ob 小鼠的胰岛素敏感性，增加肝糖原含量。据报道FGF21 可增加偏瘦小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织的葡萄糖摄取量，预示FGF21 生理功能取决于代谢状态和不同脂肪组织。进一步研究发现，FGF21 通过激活过氧化物酶增殖物活化受体辅激活因子-1（Peroxlsome Proliferator-Activated Receptor-Coactlvator-1，PGC-1）活性，成为白色脂肪组织中解偶联蛋白1（Uncoupling Protein1，UCP1）的有效诱导物，最终促进产热。此外，FGF21 通过脑-脂肪组织轴介导生热和能量消耗，改变食物摄入和能量消耗。研究表明，FGF21 能有效地诱导脂肪组织褐变，并增加腹股沟白色脂肪组织中骨形成蛋白8B（Bone Morphogenetic Protein-8B，）、碘甲腺原氨酸脱碘酶II（Type II Iodothyroninedeiodinase，）、和过氧化物酶增殖物激活受体（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor，）等生热基因的表达。

目前对FGF21 作用机制的研究多集中于啮齿类动物和人类，在家畜上的研究报道不多，尤其以猪为对象研究更鲜有报道。本课题组对禁食后猪转录组数据分析发现，多个脂质代谢的相关基因如：和诱导细胞死亡的DFF45 样效应因子b 蛋白（Cell Death-Inducing DNA Fragmentation Factor-like Effector B，）表达上调。为鉴定调控猪肌内脂肪细胞生成的关键调节因子，本研究选择为研究对象，构建基因真核表达载体并利用RTPCR 探究其在长白猪不同组织中的表达规律，为长白猪基因在脂质代谢中调节机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 6 月龄长白猪经过禁食24 h 后屠宰，其选自河北省秦皇岛市昌黎县肉联厂。采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、皮下脂肪、膀胱、背长肌、大肠（结肠）和小肠（空肠）11 种组织，样品采集后编号并迅速置于液氮中。

1.1.2 载体和菌株 pcDNA3.1+空载体为河北科技师范学院动物学实验室保存。大肠杆菌DH5菌株购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2 主要试剂 TrQuick Reagent、Methylidyne trichloride、异丙醇均市购，2×Es Taq MasterMix 购自武汉莫纳生物科技有限公司，反转录试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司，DNA 凝胶回收试剂盒、DL2000 DNA Ladder均购于北京索莱宝生物科技有限公司，qPCR SYBR Green Master Mix 购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 引物的设计与合成 根据GenBank 中收录的猪基因序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1），由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

1.3.2 总RNA 提取和cDNA 合成 按照Trizol 法分别提取长白猪11个组织的总RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测其RNA 浓度和纯度，使RNA 的终浓度为1 000 ng。根据M-MLV 酶说明书对各组织总RNA 进行反转录，反应体系为30 µL：RNA 2 μL，T18 3 μL，DEPC 水补至20 μL，在恒温反转录仪72℃放置5 min，冰上放置5 min；随后加入10 μL 反转录混合液，各物质含量为：dNTP Mix 3 μL，5×buffer 6 μL，M-MLV 0.5 μL，RNA 抑制剂0.5 μL；在恒温反转录仪中42℃反应1 h，80℃灭活15 min，置于-20℃备用。

1.3.3基因扩增 利用表1 中第1 对引物，以cDNA为模板进行PCR 扩增，反应体系为50 μL：MonAmp2X Taq Mix Pro（+Dye） 25 μL，正、反向引物（0.4 μm/μL）分别为2 μL，80 ng/μL cDNA 4 μL，ddHO 17 μL；扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 15 s，35个循环；72℃ 5 min；20℃ 5 min。产物通过琼脂糖凝胶电泳检测并用胶回收试剂盒回收PCR 目的片段，随后与pMD18-T 载体连接，再转化至DH5感受态细胞，挑取单克隆菌株并进行PCR 鉴定。重组载体作为模板用表1 中第2 对引物克隆的CDS 序列并连接到pcDNA3.1空载体上，转化到DH5感受态细胞，经培养后挑取单菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 PCR 引物序列信息

1.3.4 实时荧光定量PCR 检测在各组织中的表达量 根据SYBR Green 荧光染料法进行实时荧光定量。PCR 反应总体系为20 μL：qPCR SYBR Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddHO 7 μL。反应条件：预变性95℃ 10 min；循环反应，95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40个循环；添加熔解曲线，以每5 s 上升0.5℃的速率从60℃升高到95℃，每个样品重复3 次取平均值。利用为内参基因校正个体差异，按照2算法计算基因在各个组织的相对表达量。每组实验重复3 次，数据以平均值±标准差表示，并利用Graphpad Prim 5 软件将表达量进行单因素方差分析，不同小写字母表示存在显著差异（<0.05）。

1.3.5 生物信息学分析 对长白猪FGF21 序列进行生物信息学分析：用DNAMAN 将长白猪的FGF21 氨基酸序列与NCBI 已经公布的10个物种进行同源性比较。各物种FGF21 蛋白质序列如下：人（，登录号：NP_061986.1）；小家鼠（，登录号：NP_064397.1）；猪（，登录号：NP_001 156882.1）；普通牛（，登录号：XP_005219 543.1）；山羊（，登录号：XP_02782401 4.1）；斑马鱼（，登录号：NP_001038789.1）；家猫（，登录号：XP_003997577.2）；绿海龟（，登录号：XP_027674904.2）；蜥蜴（，登录号：XP_034992107.1）；林蛙（，登录号：XP_040182845.1）。用MEGA6.0 对长白猪与其他物种间的FGF21 氨基酸序列做多序列联配，构建系统进化树；用ProtParam预测分析长白猪FGF21 的理化性质；用SOPMA 和SWISS-MODEL 分别预测FGF21 蛋白的二级和三级结构；用Protscale、TMHMM、SignalP 对其疏水性、跨膜结构和信号肽进行预测；采用NeTPhos 3.1 Server、NetNGIyc1.0 和NetOGlyc4.0 分别预测FGF21 蛋白质的磷酸化位点、N 端和O 端糖基化位点。

2 结果

2.1 长白猪基因克隆 由图1 可知，1 号泳道条带与DNA Ladder Marker 相比单一明亮无杂带，扩增片段大小处于500～750 bp 之间。经生工生物工程（上海）股份有限公司测定1 号泳道条带产物，结果如图2 所示，该序列与NCBI 数据库中猪完整CDS 序列（登录号：NM_001163410.1）完全一致。

图1 FGF21基因CDS 区PCR 扩增图

图2 长白猪FGF21 CDS 区克隆测序结果

2.2 生物信息学分析

2.2.1 长白猪与其他物种系统进化树的构建 由图3可知，长白猪FGF21 氨基酸序列与牛、山羊和人的亲缘关系最近，与蜥蜴和林蛙的亲缘关系最远。用DNAMAN 9.0 将长白猪与其他物种序列比对分析可知，猪与牛、山羊的同源性最高，均为91.83 %，与斑马鱼、林蛙和蜥蜴的同源性较低，分别为29.10%、31.40%和44.44%。

图3 猪FGF21 与其他物种氨基酸系统进化树

2.2.2 长白猪FGF21 蛋白质理化性质预测 经克隆得到的FGF21 蛋白质分子式是CHNOS，相对分子质量为22 447.58 Da，总原子数为3 162，理论等电点（PI）为5.38，编码208个氨基酸（表2），其中，亮氨酸（Leu）个数为30，比例最高，为14.4 %，不含吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸，消光系数是20 065，估计半衰期是30 h，不稳定系数是60.01，为不稳定蛋白；脂肪系数为89.13，总平均亲水性为-0.245。

表2 FGF21 编码的蛋白质氨基酸组成

2.2.3 长白猪FGF21 蛋白质二级结构和三级结构预测 由图4A 可知，无规则卷曲占52.4%，延伸链占19.23%，-螺旋占18.75%，-转角占9.62%，且-转角分布比较分散。由4B 可知，全面模型评估值（Global Medal Quality Estimation，GMQE） 是0.46，序列相似性为0.35，模型构建符合要求，该三级结构显示其存在多无规则卷曲。采用STRING 数据库搜索FGF21蛋白质的可能相互作用蛋白质（图4C），该结果提示FGF21 可能和INS、FGFR4、EGF、FGFR3 和TEK 等蛋白质存在相互作用。

图4 长白猪FGF21 蛋白质结构和互作蛋白质预测

2.2.4 长白猪FGF21 蛋白质疏水性、信号肽及跨膜区分析 由图5A 可知，其整条氨基酸链在第21 位氨基酸处有最大疏水值2.833，在第150 位氨基酸处有最小疏水值-2.667，总平均疏水性为-0.233。因为亲水性氨基酸残基多于疏水性氨基酸残基，可推测该蛋白为亲水性蛋白。由图5B 可知，预测第27 和28 位氨基酸之间存在信号肽切割位点，根据信号肽假说推测长白猪FGF21蛋白质含有信号肽，属于分泌蛋白。同时对该蛋白质跨膜蛋白区域结构进行预测分析可知，长白猪FGF21 蛋白质没有跨膜区域结构。

图5 长白猪FGF21 蛋白疏水性和信号肽分析

2.2.5 长白猪FGF21 蛋白质磷酸化位点预测 磷酸化位点通常在苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）和赖氨酸（Lys）3个氨基酸残基上。预测结果显示长白猪FGF21 共有18个磷酸化位点，其中丝氨酸上有11个，氨基酸位置分别为34、75、78、112、121、136、151、194、199、203、205；苏氨酸上有4个，分别位于50、56、67、97；赖氨酸上有3个，分别位于131、134、206。利用在线软件NetNGIyc1.0 分析发现该蛋白无N 端糖基化位点。在线软件NetOGlyc4.0 分析发现有5个位点O端糖基化位点，分别位于151、190、194、199、203位氨基酸残基。

2.3 长白猪基因的组织表达谱分析

2.3.1 实时荧光定量PCR 的扩增曲线和熔解曲线 如图6A 所示，基因扩增曲线呈现完好的“S”形，曲线平滑未出现特殊趋势。熔解曲线均呈单峰，峰值较好，无引物二聚体，无杂峰，符合实验要求。

2.3.2 长白猪基因的组织表达谱 由图6B 可知，在长白猪的11个组织中均有表达，其中肝脏相对表达量最高，且显著高于其他组织中的相对表达量，其次为心、肺、脂肪、脾和胃，在肾脏中表达量最低。在心脏中的相对表达量显著高于肾脏、大肠、小肠、膀胱组织中的表达量，在肺脏中的相对表达量显著高于肾脏、大肠、小肠和膀胱组织中的相对表达量。其他器官组织之间相对表达量差异不显著。

图6 长白猪FGF21基因扩增曲线与熔解曲线及在不同组织中的表达量

3 讨 论

本研究成功克隆了长白猪基因的CDS 区全长序列，该序列为627 bp，编码208个氨基酸，与GenBank 数据库猪的FGF21 序列一致。FGF21 在多个物种中均有表达，其中在人和小鼠中分别由209个和210个氨基酸组成。通过氨基酸序列比对和亲缘关系分析可知，长白猪和牛、山羊的同源性较高，亲缘关系近，与林蛙同源性和亲缘性低。其中山羊、普通牛和猪属于偶蹄目，林蛙属于两栖类，该结果提示猪FGF21 蛋白质与家畜类之间的亲缘关系最近，进化过程中比较保守，此结果与李倩等在山羊中的研究结果一致。

脂肪合成和分解代谢的平衡是影响脂肪过度沉积的重要因素，探究参与脂代谢相关的调控基因并通过控制能量摄入调控猪体内脂肪沉积是畜牧业亟待解决的问题之一，目前研究表明在糖脂代谢中起到关键作用。董志昊等人研究发现小鼠处于持续高能量进食状态时，FGF21 通过激活肝激酶B1（Liver Kinase B1，LKB1）因子调节腺苷酸激活蛋白激酶（AMPActivated Protein Kinase，AMPK）磷酸化信号通路进而调节肝脏脂代谢；Kondeti 等人研究发现缺失小鼠肝脏代谢异常，表现为肝脏脂质大量沉积，转基因小鼠喂养高脂高碳食物后体重并未增加；张健等发现FGF21 可以促进肝细胞、肌肉细胞和脂肪细胞对葡萄糖的吸收作用。以上研究表明FGF21 确实在糖脂代谢中发挥调控作用，且在动物的多种组织中均有表达。本研究以为对象，探究其在禁食状态下长白猪不同组织中的表达特性，发现在长白猪11 种组织中均有不同程度的表达。其中，基因在肝脏和脂肪组织中表达量相对较高，肾脏中表达量最低，这与前人研究结果一致。杨在清等发现梅山猪FGF21 主要在肝脏、脂肪组织以及肾脏中高表达；李倩等研究表明主要在山羊的肝脏组织中表达较高，肾和背长肌中表达量最低；黄龙等在草鱼中发现主要在肌肉中高表达，肾脏和全脑中表达量较低，以上结果提示基因在不同物种和饮食状态下的表达量存在有一定的差异。在禁食状态下，长白猪基因如何在肝脏和脂肪组织表达上调是研究其作用机制的重要方面。Takeshi 等研究显示：在禁食状态下人或小鼠肝脏中的转录因子与启动子识别位点结合，引起的表达量升高，进而调节肝脏的能量代谢，提高肝脏的糖异生作用，另外，不饱和脂肪酸和胆汁酸分别通过激活PPAR和法尼酯X受体（Farnesoid X Receptor，FXR）通路增加肝脏基因的转录。在白色脂肪组织中FGF21 与UCP1 和PPAR等相互作用诱导白色脂肪组织棕色化，如敲除小鼠可导致PPAR通路受损使胰岛素敏感性降低，FGF21 可刺激UCP1的表达增加机体能量的产热。该蛋白也参与调节了米色脂肪细胞的产热，miR-182-5p 通过抑制5'-UTR核受体亚家族1d 组成员1（Nuclear Receptor Subfamily 1，Group D，Member 1，NR1D1）促进脂肪细胞中FGF21 的表达和分泌，激活了脂肪细胞中（如UCP1、PPAR和PGC-1）产热基因表达。此外，张艳在猪源细胞中超表达研究发现，参与脂肪合成的关键酶脂肪酸移位酶（Fatty Acid Translocase，FAT/CD36）和脂肪分化相关蛋白（Adipose Differentiation-Related Protein，ADRP）下调，进而抑制脂肪合成，甘油三酯含量减少，这与禁食状态下的代谢类似。以上结果提示FGF21 在多物种的不同组织中发挥重要的作用，这可能与其蛋白质结构及受体蛋白相关。

本研究通过对FGF21 蛋白质结构预测可知，该蛋白质二级结构主要以无规卷曲为主，与典型的FGFs 结构类似，且与三级结构预测结果一致；该蛋白质为亲水性蛋白，不含跨膜结构域，与藏山羊、草鱼的FGF21蛋白质预测结果一致。随后利用STRING 数据库检索与其相互作用的蛋白质发现，FGF21 蛋白质可能与FGFR3 和FGFR4 等蛋白存在相互作用。FGFR3 和FGFR4 是FGFR 家族的成员，二者作为成纤维细胞生长因子的细胞表面受体，在细胞增殖、分化中起着重要作用，推测FGF21 在发挥功能时需要与膜受体蛋白FGFR 结合，调节糖脂代谢。进一步预测FGF21 蛋白质翻译后修饰发现其含有多个磷酸化位点，这与其可能存在受体结合位点预测结果一致。研究发现当细胞中内源无FGFRs 表达时，FGF21 可激活和磷酸化下游的细胞外调节蛋白激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases，ERK）。同时，Yi 等发现小鼠原代肝细胞发现FGFR1 和-klotho 水平上调可减轻高脂饮食诱导的FGF21 信号通路紊乱，以维持代谢稳态。李倩等发现FGFR1 或FGFR2 调控山羊肌内脂肪分化。通过对以上不同物种研究发现，推测FGFR 可作为调控FGF21 分化的受体。然而长白猪中尚未报道FGF21 在肌内脂肪细胞中通过哪个受体调控肌内脂肪沉积。为此，本课题组拟利用酵母双杂交技术筛选FGF21 与受体相互作用情况，以及通过体外细胞超表达和敲除FGFR 受体检测细胞内脂肪代谢的产物及基因的表达情况。本实验结果为FGF21 在长白猪脂肪组织中结构研究和代谢机制研究提供了一定的参考依据。

4 结 论

本研究成功克隆获得长白猪基因的CDS 序列627 bp，蛋白质二级结构主要以无规卷曲为主，为亲水性蛋白且保守性强。禁食后，在肝脏中相对表达量最高，在肾脏中的相对表达量最低，揭示该基因在能量代谢方面发挥一定的作用，并为进一步探索长白猪肌内脂肪代谢的作用机制奠定了基础。