一株猪源粪肠球菌的益生性能评价

刘震坤，陈鲜鑫，任思宇，李世易

（1.四川省乐山市农业科学研究院，四川 乐山 614000；2.重庆三峡职业学院，重庆 万州 404155）

粪肠球菌是革兰氏阳性菌，能产生乳酸、乙酸等有机酸，抑制动物肠道内有害微生物的生长繁殖，维持动物肠道微生态平衡。《饲料添加剂品种目录（2013）》允许将粪肠球菌添加到动物饲料中。本研究旨在评价猪源粪肠球菌的耐酸能力、耐胆盐能力和抗氧化能力等益生性能，为相关微生物饲料添加剂的开发提供菌株来源。

1 材料与方法

1.1 材料 粪肠球菌菌株SX106 由重庆三峡职业学院实验室分离鉴定并保存；MRS培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；猪胆盐购自合肥博美生物科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 生长曲线和产酸曲线的测定 取1 mL 粪肠球菌SX106菌悬液接种于100 mL MRS液体培养基中，厌氧条件下37 ℃振荡培养，分别于第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、24 h 取适量培养液在600 nm波长下测定OD 值，同时测定培养液的pH值和乳酸含量。以时间为横坐标，以培养液OD值、pH值和乳酸含量为纵坐标，分别绘制曲线。

1.2.2 耐酸能力的测定 取1 mL SX106 菌悬液分别接种于pH 值为2.0、3.0、4.0、5.0 的100 mL MRS液体培养基中，厌氧条件下37 ℃振荡培养3 h后进行活菌计数，并计算存活率。

1.2.3 耐胆盐能力的测定 取1 mL SX106 菌悬液分别接种于0.1%、0.2%、0.3% 100 mL 猪胆盐溶液中，厌氧条件下37 ℃振荡培养3 h 后进行活菌计数，并计算存活率。

1.2.4 耐药性的测定 移取100 μL SX106 菌悬液滴至MRS固体培养基上，用涂布棒涂布均匀后放置药敏纸片，厌氧条件下37 ℃培养24 h，观察抑菌圈是否形成，并精确测量抑菌圈直径。

1.2.5 DPPH 自由基清除能力的测定 将SX106菌悬液以10 000 r/min 离心2 min，取400 μL 上清液与600 μL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（用无水乙醇配制）混合均匀后，室温下避光反应30 min，然后以10 000 r/min离心2 min，取上清液测定OD517nm值（A1）。取400 μL与600 μL 80%甲醇溶液作为对照，按照同样步骤测定OD517nm值（A2）；取400 μL 80%甲醇溶液与600 μL DPPH 无水乙醇溶液均匀混合后作为空白对照，测定OD517nm值（A0）。

DPPH自由基清除率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 生长曲线和产酸曲线 菌株SX106 在MRS液体培养基中厌氧培养24 h后，其生长曲线和产酸曲线见图1。由图可见，培养2 h后菌体迅速增长，菌液浓度迅速升高，进入对数生长期；8 h后菌体生长速度逐渐缓慢，12 h 开始进入稳定期。培养液pH值（初始6.1）在第2 h迅速下降，第12 h降至4.15，第16～24 h pH 值维持在4.05～4.07。乳酸产量随着时间延长而，不断增多，在第12 h 乳酸产量就达到45.56 mmol/L，至第24 h 最高达到53.21 mmol/L（图2）。

图1 粪肠球菌SX106的生长曲线和产酸曲线

图2 粪肠球菌SX106的产乳酸曲线

2.2 耐酸能力 由图3可见，在pH值分别为5.0、4.0、3.0、2.0 的MRS 培养基中，37 ℃厌氧培养3 h，菌株的存活率分别为98.9%、75.31%、55.25%、22.43%。表明随着MRS液体培养基初始pH值的下降，粪肠球菌菌株SX106 的存活率逐渐下降，pH值低于2.0时，生长明显受到抑制。

图3 粪肠球菌SX106在不同pH值MRS培养基中的存活率

2.3 耐胆盐能力 将菌株SX106 分别接种在含0.1%、0.2%、0.3%猪胆盐的MRS 培养基中，结果可见：随着胆盐浓度升高，菌株存活率略有下降，但均能保持95%以上的存活率。表明菌株SX106能耐受高浓度胆盐溶液，在其中可以保持良好的生长状态（图4）。

图4 粪肠球菌SX106在不同胆盐浓度的MRS培养基中的存活率

2.4 药敏性 采用纸片扩散法测定菌株SX106对16 种药物的敏感性（表1），结果可见：该菌株对氟苯尼考和多西环素敏感；对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、头孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林和恩诺沙星中度敏感；对青霉素、链霉素、甲氧氨苄嘧啶、氨苄西林、阿奇霉素、卡那霉素和庆大霉素不敏感。

表1 粪肠球菌SX106药敏试验结果 mm

2.5 DPPH自由基清除能力 通过计算得出，菌株SX106对DPPH自由基的清除率为88.24%。

3 讨论

3.1 生长特点 微生物生长曲线包括迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期。粪肠球菌SX106在MRS液体培养基中厌氧培养2 h后即进入对数生长期，菌体生长迅速，菌液浓度迅速升高，12 h后进入稳定期。粪肠球菌能够利用培养基中的营养物质产生乳酸、乙酸等有机酸。在对数期，随着时间延长，乳酸产量逐渐升高，pH值降低，进入稳定期后趋于平稳。

3.2 耐酸能力 胃酸是成年动物胃液的主要成分之一，pH 值为0.5～1.5。动物摄取食物和饮水后，胃液被稀释，pH 值升高；另外，一部分食物具有一定的系酸力，能够中和一部分胃酸，因此胃内容物pH 值通常保持在2.0～3.0。高浓度的胃酸具有抑制或杀死胃内细菌的作用。因此，乳酸菌要到达大肠发挥作用，必须通过胃酸的腐蚀，具有较高的存活率。菌株SX106 在pH 值3.0 的MRS 液体培养基中培养3 h，其存活率超过50%；pH值2.0时，存活率下降至22.43%。

3.3 耐胆盐能力 胆盐能改变细菌细胞膜的通透性，最终造成细菌死亡［1］。因此，能否耐受高浓度胆盐也是衡量益生菌优劣的重要指标。小肠内胆盐的浓度通常在0.03%～0.3%［2-3］。本试验将菌株SX106 接种于含有0.1%、0.2%、0.3%胆盐的MRS液体培养基中，以此衡量该菌株的胆盐耐受能力。结果显示：该菌株在0.3%胆盐中培养3 h仍能保持95%以上的存活率。

3.4 药敏性 粪肠球菌作为革兰氏阳性菌的耐药指示菌，其耐药机制复杂，存在对某些抗菌药物的固有耐药性及获得性耐药［4-6］。益生菌的耐药性是评价其安全性的重要内容。本试验研究了SX106对16种常见药物的敏感性，结果表明其对环丙沙星、左氧氟沙星、头孢曲松、头孢噻肟、氧氟沙星、阿莫西林和恩诺沙星中度敏感；对青霉素、链霉素、甲氧氨苄嘧啶、氨苄西林、阿奇霉素、卡那霉素和庆大霉素不敏感。这与一些研究报道不一致［7］，可能是因为不同来源的粪肠球菌在耐药性方面存在差异。

3.5 抗氧化能力 研究表明，乳酸菌能够清除动物肠道内的活性氧分子，具有一定的抗氧化能力。评价其抗氧化能力的重要指标之一是对DPPH自由基的清除率［9-11］。菌株SX106对DPPH自由基的清除率达到88.43%，表明该菌株具有较强的抗氧化能力，但与部分文献报道［12］不同，原因可能是不同菌株间的差异造成的。

4 结论

本研究得出：粪肠球菌SX106 能够在低pH环境下（3.0）有50%以上的存活率，在高浓度胆盐环境中存活率达到95%以上；对氟苯尼和多西环素敏感；具有良好的DHHP 自由基清除能力。对该菌株的其他益生性能后续将作进一步研究。