正十六烷降解菌的分离、鉴定及降解特性研究

李迎鹤，刘 东，于 杰，赵平南，张潇元，苏俊涛，韩 松*

(1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040; 2.中国昆仑工程有限公司吉林分公司，吉林 吉林 132000)

石油工业在迅猛发展的同时，其背后也潜藏着一系列不容小觑的环境污染问题，成为紧随农药污染之后的又一大环境危害，尤以石油污染土壤为甚.据统计，大庆油田平均作业一口井，产生的落地原油可达1.0 t，回收利用后有约22%的落地原油会对土壤造成严重污染[1].石油污染物进入土壤后会导致土壤pH降低[2]，土壤理化性质遭到严重破坏[3]，进而影响作物生长[4]，甚至会富集到动物和人体之上，产生致癌、致畸、致突变的“三致”作用[5].鉴于此，探寻一种经济、高效、无次生污染物的微生物修复技术迫在眉睫.

石油污染土壤的修复技术主要包括物理修复法、化学修复法以及生物修复法，而微生物修复法则在生物修复领域中举足轻重.与其他手段相比，微生物修复法具有降解率高、成本低、无二次污染产生等优点[6].烷烃作为石油的主要组分，占石油含量的50%～95%[7].在烷烃污染物中，短、中链烷烃易被降解；而长链烷烃通常情况下比较稳定，以固态形式存在，不易被生物降解，因此对土壤污染更为严重[8]，正十六烷正是长链烷烃中的一大代表性物质，对环境的持久性危害更强[9]，因此利用微生物修复技术进行降解更为理想.目前从石油污染土壤中筛选出正十六烷降解菌主要有无色杆菌属(Achromobactersp)[10]、假单胞菌属(Pseudomonassp)[11]、不动杆菌属(Acinetobactersp)[12]等.

本文以正十六烷为研究对象，通过调控外界环境压力，从大庆石油污染土壤中分离、驯化、筛选出一株以正十六烷为唯一碳源的高效降解菌株.在对菌株进行鉴定的基础上，研究不同培养条件与正十六烷降解率之间的动态关系，为石油烃污染土壤的修复提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 土壤样品

大庆油田附近的石油污染土壤.

1.2 主要培养基

无机盐培养基：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5g，CaCl20.02 g，Fe2(SO4)30.02 g，蒸馏水定容至1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

正十六烷无机盐培养基：1 L无机盐培养基加入10 mL正十六烷.

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g(固体LB培养基加入琼脂15 g)，蒸馏水定容至1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

1.3 正十六烷降解菌的富集、驯化与筛选

称取5 g土壤样品加入到50 mL无菌水中，于30 ℃，150 r/min的条件下在恒温振荡培养箱中培养6 h；取充分振荡后的富集液1 mL，加入到含1 mL正十六烷的无机盐液体培养基中，于30 ℃，150 r/min的条件下在恒温振荡培养箱中培养7 d，7 d后从上述培养基中移取1 mL发酵液，加入到另一含1 mL正十六烷的无机盐液体培养基中，连续转接5次，培养条件同上.

取最后一次转接的发酵液，梯度稀释后涂布于LB平板上，于30 ℃恒温培养箱中培养12 h后进行划线分离，将得到的单菌落接入含1 mL正十六烷的无机盐培养基中，若出现浑浊，则该菌种为正十六烷降解菌.

1.4 菌株的鉴定

将最后筛选出的菌株进行菌株形态特征观察，并将菌株送至测序公司进行16Sr DNA基因测序，将得到的序列信息输入到NCBI系统，进行Blast同源性比对分析，并利用MEGA7软件构建系统发育树.

1.5 正十六烷的萃取及分析方法

取5 mL正己烷加入到培养7 d的100 mL正十六烷无机盐液体培养基中，转移液体至125 mL分液漏斗中，反复振荡，8 000 r/min离心20 min，吸取上层有机相，重复萃取2次，合并萃取液并加入一定量的无水Na2SO4，待干燥后将萃取液经0.22 μm微孔滤膜过滤除杂，取0.1 mL萃取液转移至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度线，充分摇匀，进行气相色谱测定.

采用GC7900气相色谱仪测定降解后正十六烷的残余量.检测条件：HP-5MS色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，FID检测器，载气为高纯氮气，氢气流速为30.0 mL/min，空气流速为300 mL/min，进样口和检测器温度都设定为280 ℃，进样量为1.0 μL.色谱柱升温程序如下：初始柱温为120 ℃，保持1 min，以15 ℃/min的升温速率上升至280 ℃，保持1 min.

1.6 不同条件下菌株对C16降解率的影响

以正十六烷为唯一碳源，考察正十六烷体积分数(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、菌液接种量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)、NaCl质量浓度(1 g/L、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L)、降解时间(2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d)对正十六烷降解率的影响.

1.7 菌株细胞表面疏水性能的测定

菌株的疏水性能采用细菌黏着碳氢化合物法Bacterial Adhesion To Hydrocarbons(BATH)测定，将菌株在以正十六烷为唯一碳源的无机盐培养基中培养7 d后，4 000 r/min离心10 min，收集菌体并调节OD600nm为1.0左右.在10 mL离心管中加入菌悬液6 mL，再加入0.5 mL正十六烷，空白对照组不加正十六烷，在室温下剧烈振荡60 s，静置60 min，待分层后用枪头快速伸入下层溶液，缓慢吸取溶液3 mL，在600 nm波长处测定吸光度，设置3个平行试验和1个空白对照组.菌体细胞表面疏水性能(BATH)按照下式计算：

BATH%=(OD600对照组-OD600实验组)/OD600对照组×100%

1.8 菌株乳化性能的测定

将培养7 d的发酵液离心后去除菌体，在10 mL离心管中加入4 mL正十六烷，再加入4 mL离心后去除菌体的上清液，设置3个平行试验和1个空白对照组，于超声波仪中超声10 min，使正十六烷与上清液充分混合，静置24 h，观察正十六烷与上清液的分界面和乳化效果.乳化率(E24%)= 乳化层高度/液体总高度×100%.

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

以正十六烷为唯一碳源，从石油污染土壤中筛选出一株正十六烷降解菌，命名为L1，该菌株在LB平板上的形态如图1所示.菌落呈圆形，中间凸起，淡黄色，表面光滑，边缘整齐.

图1 菌株在LB平板的菌落形态

将L1菌株的16S rDNA基因序列通过Blast同源性比对，结果表明，该菌株与AcinetobacterhaemolyticusstrainATCC 17906的相似度最高为99.85%，确定该菌株为溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus)，并且他们在基于16S rDNA的菌株系统发育进化树中也呈现明显的亲缘关系，如图2所示.

图2 利用邻近法构建的基于16S rDNA 的菌株系统发育进化树

2.2 不同反应条件下菌株对正十六烷降解率的影响

2.2.1 正十六烷初始体积分数对降解率的影响

在OD600nm为1，pH值为7，菌液接种量1%，NaCl质量浓度5 g/L，35 ℃，150 r/min的条件下，降解7d后不同正十六烷体积分数对降解率的影响如图3所示.由图3可知，当正十六烷体积分数为0.1%(773.4 mg/L)时，降解率最高，7 d后达到了88.0%.随着正十六烷体积分数的升高，降解率却不断下降，这是因为正十六烷作为唯一碳源，在适宜浓度范围内能够促进菌株的生长，并有较高的降解率；当正十六烷体积分数较高时，则会产生抑制作用，反而会对菌株产生一定的毒害作用[13]，进而影响降解率.当正十六烷体积分数达到2.0%(15 468 mg/L)时，降解率仍达25.9%，说明在正十六烷体积分数较高环境下，菌株仍具备一定的降解能力，可用于高体积分数正十六烷的降解体系.在后续试验中，选择正十六烷体积分数为0.5%(3 867 mg/L)作为底物浓度.

图3 不同正十六烷体积分数对降解率的影响

2.2.2 初始pH对正十六烷降解率的影响

在OD600nm为1，正十六烷体积分数0.5%(3 867 mg/L)，菌液接种量1%，NaCl质量浓度5 g/L，35 ℃，150 r/min的条件下，降解7 d后不同pH值对正十六烷降解率的影响如图4所示.从图4中可以看出，该菌株具有广谱性，在5～9的pH范围内对正十六烷均有一定的降解作用，在pH值为8时，正十六烷降解率最高，为48.8%.在大多数的石油降解研究中，正十六烷降解菌的最适pH值为中性.崔倩倩等[14]从石油污染土壤中分离出一株琼氏不动杆菌属(Acinetobacterjunii)，在pH为7时，对体积分数为0.1%的正十六烷降解率可达75%.张洁等[15]从油泥中筛选出两株正十六烷降解菌，其最适降解pH均为7.而本试验中的菌株更适宜在偏碱性环境中生长、嗜盐度高，对于大庆油田等高盐地区的石油污染土壤可起到一定修复作用.

图4 不同pH对正十六烷降解率的影响

2.2.3 菌液接种量对正十六烷降解率的影响

在OD600nm为1，正十六烷体积分数0.5%(3 867 mg/L)，pH值为8，NaCl质量浓度5 g/L，35 ℃，150 r/min的条件下，降解7 d后不同菌液接种量对正十六烷降解率的影响如图5所示.

图5 不同菌液接种量对正十六烷降解率的影响

由图5可知，随着菌液接种量的增加，其降解率的变化并不明显，导致这一现象的原因可能是菌株自身降解能力有限，即一定量的菌株对应降解一定量的正十六烷，当达到菌株降解极限后就不再继续降解.后续实验中选用降解率相对较高的菌液接种量4%作为最适接种量.

2.2.4 NaCl质量浓度对正十六烷降解率的影响

在OD600nm为1，正十六烷体积分数0.5%(3 867 mg/L)，pH值为8，菌液接种量4%，35 ℃，150 r/min的条件下，降解7 d后不同NaCl质量浓度对正十六烷降解率的影响如图6所示.由图6可知，NaCl质量浓度在1～5 g/L时，正十六烷降解率均在50%以上，NaCl质量浓度为5 g/L时，正十六烷降解率最高，为57.9%.适量的NaCl能够促进菌株对正十六烷的降解，但当NaCl质量浓度较高时，细胞的渗透压改变[16]，菌株生长受到抑制，进而影响菌株降解率.当NaCl质量浓度提高到20 g/L时， 正十六烷降解率仍达34.9%， 说明该降解菌对于NaCl具有一定的耐受性， 对于大庆盐碱地的石油污染土壤的生物修复具有一定促进作用.

图6 不同NaCl质量浓度对正十六烷降解率的影响

2.2.5 正十六烷降解率和菌株生物量随时间的变化

在最佳降解条件下，不同培养时间对菌株OD600 nm和正十六烷降解率的影响如图7所示.由图7可知，菌株生物量与正十六烷的降解率呈正相关，其中菌株的OD600 nm变化不大，2 d时就有较大的OD值，并以较小的幅度稳步上升.正十六烷降解率缓步提升，这与菌株的生长速率有关，12 d后降解率可达62.0%.

图7 正十六烷降解率和菌株生长量随时间的变化

2.3 菌株细胞表面疏水性和乳化性的测定

利用细菌黏着碳氢化合物法测定菌株细胞表面的疏水性能，经计算细胞表面疏水性为77.2%，结果与菌株细胞表面的疏水性呈正相关[17].疏水性越好证明该菌株对正十六烷的吸附性越好，这有利于菌株在烃类物质上生长，促进菌株对正十六烷的降解，提高正十六烷降解率.

经计算该菌株的乳化率(E24%)为33.8%.乳化剂是一类表面活性剂，具有亲水基和亲油基，乳化剂能够将难溶于水的正十六烷带入水中，增大水中的菌株与正十六烷的接触面积，有利于菌株的生长，进而促进菌株对正十六烷的降解，提高降解率.

3 结 语

采用持续调控正十六烷作为环境选择压力，从采自大庆石油污染土壤样品中驯化获得正十六烷降解菌，经菌株形态特征观察和16Sr DNA基因测序，鉴定该菌株为溶血不动杆菌(Acinetobacterhaemolyticus).通过单因素试验得出该菌株的最适降解条件，在pH为8，菌液接种量4%，NaCl质量浓度5 g/L，35 ℃，150 r/min的条件下，12 d后对体积分数为0.5%(3 867 mg/L)的正十六烷降解率可达62.0%.所获菌株为嗜盐性菌株，具有良好的耐盐碱性，且兼具较为良好的乳化性能和疏水性能，能够提高正十六烷在水中的溶解度，进一步促进菌株对正十六烷的降解能力，显著提升降解率；本研究也为高盐地区的石油污染土壤修复提供了一定的理论依据.