羔羊睾丸细胞酵母双杂交cDNA文库构建及鉴定

杨 倩, 包涛涛,2, 鲜思美,3, 张 友, 梁 倩, 顾庆林

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省黔东南州农业农村局，贵州 黔东南 556000； 3.贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025)

羔羊睾丸(lamb testicular, LT)细胞适用于多种病毒的增殖，如山羊痘病毒(goatpoxvirus, GTPV)、绵羊痘病毒(sheeppoxvirus, SPPV)以及羊口疮病毒(orf virus, OrfV)等[1-3].其中，OrfV属于痘病毒科副痘病毒属成员，其分布于全球范围内，在许多国家流行[4-6].OrfV主要侵害宿主的皮肤和黏膜，造成严重的持续性感染和继发性感染，对泌乳母羊和新生羔羊危害极大，会给养羊业造成巨大的经济损失[7-8].OrfV在长期进化过程中，形成了一套独特的免疫调节策略，以此庇护种群复制和免疫逃逸[9].早在1959年，Plowright et al[10]就利用LT细胞成功地对OrfV进行了分离.但是到目前为止，OrfV与宿主互作的具体机制仍未明确.

cDNA文库是研究基因组学的基本工具之一，它是以组织或细胞的mRNA为模板，逆转录合成双链cDNA(ds cDNA)后，与适当的载体连接并转化至受体菌，包含细胞全部mRNA信息的cDNA克隆子群即为该组织或细胞的cDNA文库[11].目前，常用的载体为噬菌体或质粒载体.对于真核细胞来说，cDNA文库是已经去除了内含子的cDNA，比基因组DNA文库小很多，因此，易从中筛选和克隆到所需要的目的基因.cDNA文库主要包括经典cDNA文库、标准cDNA文库、酵母双杂交cDNA文库、差示cDNA文库、限制性cDNA文库等.近年来，随着生物技术的不断发展，构建cDNA文库的方法在逐渐改进，主要有Cap-trapper、Cap-jumping、Oligo-capping及SMART法等[12].其中，SMART法较其他方法便捷，其无需分离、纯化mRNA，且得到的cDNA为全长cDNA.

基于此，本研究采用SMART技术合成ds cDNA，通过同源重组的方法将cDNA克隆至编码转录激活结构域(activation domain, AD)的pGADT7-Rec载体，以此构建LT细胞的酵母双杂交cDNA文库，旨在为进一步筛选OrfV与LT细胞的互作蛋白及其互作机制的研究提供生物材料.

1 材料与方法

1.1 材料

羔羊睾丸组织由贵州省畜牧兽医研究所惠赠；RPMI-1640培养基(货号:C11875500BT)、胰酶(货号:25200056)均购自Gibco公司，胎牛血清(货号:11011-8611)购自四季青公司，Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System试剂盒(货号:630490.内含cDNA文库构建试剂盒、CHROMA SPINT TE-400纯化柱、pGADT7-Rec载体、Y187菌株、YPDA培养基、SD/-Leu缺陷培养基以及酵母转化试剂盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2)、Advantage 2 PCR Kit(货号:639201)均购自Clontech公司.

1.2 LT细胞分离培养

参考文献[3]进行LT细胞的分离培养.将新采集的睾丸用灭菌的PBS反复洗涤3次后，放入盛有75%(体积分数)酒精的烧杯内，数秒后取出并放入无菌平皿中；用灭菌的剪刀剪开睾丸的被膜、白膜，钝性分离睾丸组织，尽可能地收集睾丸的实质，灭菌PBS反复洗涤组织，直到没有血丝为止；将组织剪为约5 mm3的碎块后，加入约4倍体积的胰酶，倒入离心管内，放入37 ℃水浴锅中30 min，每隔10 min振荡一次，4 000 r·min-1离心5 min，使组织和液体分离；弃上清液，把组织倒入50 mL的小烧杯中，取10 mL配好的含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液加入离心管中，用移液管反复吹打后，倒入小烧杯中，再反复吹打，使其细胞分散；将反复吹打的组织和液体经灭菌的8层纱布过滤，滤液加入剩余的培养液，充分混匀；分装，标记，放入37 ℃含5% CO2的培养箱中培养.细胞稳定培养2代后用于后续细胞总RNA的提取.

1.3 LT细胞总RNA提取

待第2代LT细胞铺满细胞瓶时，弃去培养液，PBS洗涤3次后收集细胞，采用Trizol法[13]提取细胞总RNA并测定其浓度(Thermo Fisher Scientific, NanoDrop One)，另取RNA样本经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测.

1.4 cDNA第一链合成

按照文库构建试剂盒说明书，取1 μL总RNA进行cDNA第一链合成.

1.5 ds cDNA合成及纯化

利用LD-PCR将cDNA第一链合成ds cDNA.反应总体积为100 μL：cDNA第一链2 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 2 μL，50×dNTP Mix 2 μL，上、下游引物各2 μL，10×Advantage 2 PCR buffer 10 μL，10×Melting Solution 10 μL，dd H2O 70 μL.反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min(每个循环增加5 s)，总共24个循环；68 ℃ 5 min.反应完成后取7 μL产物经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测.

根据试剂盒说明书，利用CHROMA SPINT TE-400纯化柱对LD-PCR扩增得到的ds cDNA进行纯化，取2 μL纯化后的ds cDNA经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测.

1.6 文库构建

用PEG/LiAc法[14]制备Y187酵母感受态细胞.按照文库构建试剂盒说明书，利用同源重组方法，将18 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec(0.5 μg·μL-1)、20 μL Yeastmaker Carrier DNA(已变性)共转化到Y187酵母感受态细胞中，最后用15 mL生理盐水重悬细胞.将转化后的菌液全部涂布于SD/-Leu固体培养基上，30 ℃倒置培养3～5 d至菌落出现.当SD/-Leu培养基上铺满菌落时，4 ℃冷却培养板4 h，每个平板中加入5 mL YPDA冻存液(含25%甘油的YPDA液体培养基)，用无菌玻璃棒刮下酵母菌落，收集的液体保存于-80 ℃.

1.7 文库质量评价

取10 μL文库构建得到的菌液，按102、104、106稀释，分别取50 μL涂布于SD/-Leu固体培养基上，每个稀释度3个重复，30 ℃倒置培养3～5 d，对生长的菌落进行计数以计算文库滴度和文库容量.文库滴度/(CFU·mL-1)=菌落数×稀释倍数/涂布体积；文库总容量/CFU=文库滴度(CFU·mL-1)×cDNA文库总体积(mL).从SD/-Leu固体培养基上长出的单菌落中随机挑取34个单菌落，用10 μL无菌去离子水重悬菌落，以该混悬液为模板，利用文库载体pGADT7-Rec通用引物(上游引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′，下游引物5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′)对其进行PCR扩增，以检测文库重组率及多态性.

2 结果与分析

2.1 LT细胞的形态

图1 分离的LT细胞(100×)Fig.1 LT cells isolated (100×)

在倒置显微镜(CNOPTEC, BDS400)下可观察到分离的LT细胞贴壁后呈长梭形(图1).

2.2 LT细胞总RNA的提取

经Trizol法提取的总RNA浓度为363.10 ng·μL-1，其D260 nm/D280 nm=1.90，D230 nm/D260 nm=1.88；经琼脂糖凝胶电泳检测可见3个条带，28S rRNA和18S rRNA条带清晰，亮度比接近2∶1，5S rRNA条带亮度较弱(图2).这表明提取的RNA样本纯度较高，具有良好的完整性，可用于后续cDNA文库的构建.

2.3 ds cDNA的合成及纯化

经LD-PCR扩增后的ds cDNA呈现弥散状分布(图3)；经CHROMA SPINT TE-400纯化柱纯化后,ds cDNA中小于250 bp的片段被去除，多处于250～2 000 bp(图4).这表明纯化后的ds cDNA丰度较高，符合建库要求.

M.DL2 000 DNA marker; 1.总RNA样品.图2 LT细胞总RNA电泳分析Fig.2 Electrophoretic analysis of total RNA in LT cells

M.DL5 000 DNA marker;1.纯化后的cDNA.图4 纯化后cDNA样本电泳分析Fig.4 Electrophoretic analysis of cDNA samples after purification

2.4 文库质量

2.4.1 文库滴度及总容量 102、104稀释度平板上单个菌落不可计数，106稀释度平板上3个重复的单个菌落数分别为12、12和11个.由此计算出文库滴度为2.33×108CFU·mL-1，文库总容量为3.5×109CFU.这表明文库中克隆子数量满足建库要求，符合其评价标准[15].

2.4.2 文库重组率及多态性 从SD/-Leu固体培养基上随机选取34个单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增阳性率达100%，文库插入片段大小为250～2 000 bp，平均大小约为1 000 bp(图5).34个单菌落均扩增出特异性条带，由此计算出文库重组率达100%，且具有较好的多态性.这表明本研究构建的cDNA文库合格，可用于后续酵母双杂交试验.

3 讨论

Fields et al[16]发明了酵母双杂交技术，此后该技术被不断改进与完善，已成为研究蛋白间相互作用的重要方法之一[17].酵母双杂交技术巧妙地把复杂的蛋白互作研究转换成简易的核酸研究，并能进行大规模的蛋白筛选[18-19]；同时，该技术可捕捉到微弱、瞬时的蛋白互作，不需要进行蛋白质纯化等一系列繁琐的操作，避免了如蛋白变性等引起的试验误差，能更好地呈现细胞内蛋白互作的真实情况[20].

M.DL5 000 DNA marker;1～34.随机挑取的单菌落.图5 cDNA文库菌落PCR检测Fig.5 PCR detection of cDNA library colonies

OrfV感染引起的疾病降低了养羊业的经济效益，并给世界公共卫生安全带来巨大隐患.已有多位学者构建了酵母双杂交cDNA文库，并利用酵母双杂交技术筛选出与OrfV互作的宿主细胞蛋白：Chen et al[21]通过构建羊鼻甲骨细胞(primary ovine fetal turbinate cells, OFTu)cDNA文库，利用酵母双杂交技术成功筛选出与OrfV 002蛋白互作的宿主蛋白S100A4，并发现OrfV 002与S100A4相互作用可抑制NF-κB信号通路激活；Long et al[22]也通过构建OFTu酵母双杂交cDNA文库，利用酵母双杂交技术筛选出11个与OrfV 024互作的宿主细胞蛋白；Tian et al[23]通过构建绵羊睾丸细胞(sheep testicular cells, STCs)酵母双杂交cDNA文库，成功筛选出5个能与OrfV 125蛋白互作的宿主细胞蛋白，其中，BIRC5能抑制细胞凋亡、促进细胞转化、参与有丝分裂.研究表明，OrfV接种于LT细胞并传至17～36代后，活力仍达97%以上[3].鉴于OrfV在LT细胞上稳定的增殖特性，本研究选择构建LT细胞酵母双杂交cDNA文库.

cDNA文库质量的评估通常需要借助3个指标，分别为文库容量、文库重组率以及插入片段大小.其中，文库容量反映了cDNA文库的覆盖度，理论上一个覆盖度完整的cDNA文库容量至少为1×106CFU[15].本研究构建的cDNA文库滴度为2.33×108CFU·mL-1，文库总容量为3.5×109CFU，符合理论要求.重组率和插入片段大小反映cDNA序列的完整性，SMART法要求重组率大于85%，且插入片段的大小应在200 bp以上[12,24].经PCR检测，本研究构建的cDNA文库重组率达100%，且多态性良好，插入片段大小为250～2 000 bp，符合SMART法的要求.