结核分枝杆菌对德拉马尼耐药及其分子机制研究进展

周明 刘皇容 唐柳生 刘桑 刘爱梅

由结核分枝杆菌引起的结核病(tuberculosis，TB)是一种慢性传染病，也是目前全球传染病致死的重要原因，一线抗结核药物治疗仍是治疗结核病的主要手段[1]，但随着耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现，终止结核病仍然是一种愿望，耐药结核分枝杆菌的出现增加了结核病防治的难度[2]，并阻碍终止结核病目标的实现，迫切需要具有安全性的新型抗结核药物来扭转局势。

一、德拉马尼(Delamanid，Dlm)的临床应用

2014年欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)和世界卫生组织(WHO)批准德拉马尼用于MDR-TB患者的治疗[3]，德拉马尼治疗结核病与其他二线抗结核药物相比，不受肝微粒体酶活性的影响，主要通过血浆白蛋白代谢和小部分经细胞色素P450酶参与的多种代谢途径而非全部通过肝脏代谢，因此，德拉马尼肝毒性较小[4-5]，并具有更好的耐受性及更高的安全性，是一种很有应用前景的新型抗结核药品。

临床研究证实，德拉马尼无论是在体内还是在体外均具有较高的抗菌活性，可有效缩短MDR-TB患者疗程，有可能在MDR-TB的治疗方面发挥重要作用[6]。2012年，Skripconoka等[7]通过一项纳入400余例MDR-TB和XDR-TB患者的德拉马尼临床研究发现，在使用德拉马尼治疗6个月，结合优化的背景方案，可以改善治疗结局，降低MDR-TB和XDR-TB患者的病亡率，Wells等[8]也表达了同样的观点。2015年，一篇有关德拉马尼的综述中，阐述德拉马尼在MDR-TB患者中普遍耐受性良好，最常见的报道是胃肠道不良事件和失眠。虽然以德拉马尼为基础的治疗QT间期延长的发生率较高，但它与晕厥和心律失常等临床症状无关[9]。2017年，一项关于德拉马尼治疗MDR-TB和XDR-TB患者进行的回顾性队列研究中显示，用德拉马尼治疗的XDR-TB患者有良好的治疗反应，个别患者延长QT延长，心脏毒性罕见[10]。

德拉马尼或者联合其他药物治疗的MDR-TB和XDR-TB的研究报道中显示，经过痰培养，患者2个月末痰培养阴转率提高[11-12]，说明德拉马尼是目前提高治疗MDR-TB患者治疗效果的关键药物，是对治疗选择的重要组成部分。2012年，一项德拉马尼治疗MDR-TB患者的研究中，痰培养转化率在2个月时增加[13]。2019年，一项评估德拉马尼的疗效和安全性的Ⅲ期临床试验在7个国家13个研究现场进行，714例结核病患者参与，研究发现与安慰剂组相比，德拉马尼组6个月内痰培养阴转时间并没有显著减少，说明短期应用疗效差异无统计学意义[14]。对于这类差异性的研究结果的存在，需要进一步研究以了解德拉马尼在MDR-TB治疗中的作用机制。

二、德拉马尼的抗菌机理

德拉马尼又称OPC-67683，是一种新型抗结核药品，它是一类双环硝基咪唑化合物，能抑制分枝杆菌细胞壁成分甲氧基分枝杆菌酸和酮基分枝杆菌酸的合成[15-16]。与目前的抗结核药品相比，对处于复制、休眠期的结核分枝杆菌及胞内结核分枝杆菌均具有强效杀灭作用[17]。德拉马尼是一种前药，需要脱氮黄素(辅因子F420)依赖的硝酸还原酶ddn(Rv3547)代谢激活才能发挥抗结核作用[18]。

德拉马尼应用于临床1年便出现了耐药的现象，目前许多学者研究认为，结核分枝杆菌对德拉马尼耐药主要与激活前体药物所需酶功能丧失有关，激活德拉马尼所需的辅因子F420是由fgd1基因编码的一组酶合成并重新激活fbiA,fbiB和fbiC，因此，参与德拉马尼发挥抗菌作用的任一基因的突变可能会引起结核分枝杆菌耐药[19]。

三、德拉马尼药物敏感性试验(简称“药敏试验”)

对于德拉马尼的药物敏感性试验，已经提出了几种药敏方法，但是目前没有一种方法是标准化的，最近，世界卫生组织确定了几种方法的德拉马尼药敏的临界浓度，Middle Brook 7H11琼脂比例法测定的最低抑菌浓度(MIC)测定为0.016 mg/L,MGIT 960液体药敏试验测定的MIC为0.06 mg/L[20]，然而，药敏试验目前还没有得到广泛的实现，大多数实验室还没有或者只是最近才开始开发用于常规开展德拉马尼药物敏感性试验项目。MGIT 960液体药敏试验是目前德拉马尼药物敏感性试验中的参考方法。不同研究报告的MIC数据见表1，最初的MGIT 960检测野生菌株德拉马尼耐药性结果表明，MDR和pre-XDR的敏感菌株MIC为0.005～0.04 mg/L，耐药菌株的MIC为0.32 mg/L[21]，随即有研究指出XDR菌株的MIC为0.32 mg/L[22]和MDR耐药菌株的MIC为0.01 mg/L[23]， 使用刃天青微量稀释法 (REMA) 建立德拉马尼的药敏方案，未经治疗的敏感株MIC为0.125 mg/L[22]，有关此方法的其他研究中结核分枝杆菌遗传变异株的MIC为0.12～4 mg/L[24]，耐药菌株MIC为0.23～2 mg/L之间不等[22-25]，在琼脂比例法(7H10 或 7H11培养基)的研究中，敏感菌株MIC为0.125 mg/L[22]，有些研究为0.001～0.05 mg/L[26]，耐药菌株的差异较大MIC在0.03 ～0.32 mg/L不等[27]，Yang等[28]用微量肉汤稀释法(BMD)检测420例XDR-TB和MDR-TB菌株，敏感菌株的MIC≤0.0125 mg/L，耐药菌株的MIC>0.32 mg/L，此方法的另一项研究中未经治疗的结核病患者的突变株的MIC为0.015～0.03 mg/L，1例死亡患者的MIC>8 mg/L[29]。2018年，Rancoita等[30]用微量滴度平板试验UKMYC5检测19株外部质量评估(EQA)菌株，其菌株的MIC为0.06 mg/L。

表1 德拉马尼的药物敏感性试验方法及MIC浓度

续表1

这些实验数据为指导德拉马尼治疗MDR-TB提供了参考。然而，不管治疗前耐药情况如何，在治疗前和治疗期间对德拉马尼进行定期的药敏试验将有助于提高耐药结核病的早期诊断，降低耐药结核病传播的可能性，具有重要的公共卫生价值。

四、德拉马尼耐药流行病学调查

德拉马尼治疗结核病的报道中，通过体外药敏试验获取了耐药的实验数据，原发耐药的实验中，2017年，在MiddleBrook 7H9琼脂培养基中检测了来自中国的未经德拉马尼治疗患者的90株XDR结核分枝杆菌的体外德拉马尼敏感性，在4株(4.4%)分离株中发现MIC升高[27]。2019年，一项来对自中国的220株未接触过德拉马尼的耐药菌株进行体外检测，共检出7株(3.18%)[31]。另一项研究中琼脂比例法对460株来自不同地域的结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验，只有2株获得性耐药[26]。有关德拉马尼耐药率的数据有限，还需要更多的研究更广泛的人群，为德拉马尼指导治疗耐多药结核提供参考。

五、德拉马尼耐药分子机制

有研究证明德拉马尼与另一种硝基咪哩类药物PA-824有类似的耐药机制[32]。2011年，在一项有关fgd1和ddn多样性对PA-824体外敏感性的研究中发现，fgd1和ddn这两个基因的多态性是特定于几个基因型或个别菌株的，没有显著影响PA-824的MIC，说明PA-824抗性基因存在较大的遗传多样性[33]。Haver等[18]报道了ddn有19种不同类型的突变，基因的多态性，氨基酸的插入，密码子停止等，突变频率最高的是Ser-Stop早期的终止密码子，然而研究没有MIC实验，无法判断和表型的关系。2016年Schena等[22]对来自4个不同地区的159株未经德拉马尼治疗的临床菌株利用全基因组测序(WGS)遗传分析显示，具有ddn和fbiA基因终止密码子突变，ddnTrp-88STOP和fbiALys-250STOP的菌株都对德拉马尼耐药，研究的155株敏感菌株中未发现基因突变。2018年韩国一项MIC和耐药性相关基因突变的研究中，对未应用过德拉马尼的420个临床结核菌株测定MIC，并对耐药性相关基因PCR扩增测序分析，发现41株(9.76%)对德拉马尼产生耐药性，41株耐药菌株中，有33株具有fbiA或ddn的突变，在ddn基因的Gly81ser和Gly81Asp突变与德拉马尼耐药性相关[28]。研究未经治疗的631株分离株对德拉马尼抗性的相关基因中通过WGS分析发现ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC的点突变、移码突变、终止密码子突变等形式，其中与最高MIC值相关的是携带ddn或fbiA基因中移码或停止密码子突变的分离株，而ddn和fgd1的点突变可能在降低蛋白质的稳定性中发挥作用，蛋白稳定性的预测影响与MIC结果一致,通过ddn中N91T突变的分析还发现N91T参与了降低辅助因子f420-h2的结合亲和力，但也参与了破坏ddn折叠的不稳定[24]。

ddn可能只是对硝基咪唑前药的活化很重要的一类酶之一，调解 PA-824 的新陈代谢导致活性氮物种的释放[34]，但对它的活化机制和细胞功能特异性的了解还有很多的未知，需要更多的研究探索ddn的结构及突变的方式与耐药性具体相关性。

F420氧化还原循环需要依赖NADP的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(fgd1)来催化葡萄糖-6-磷酸氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯。两项研究报道了两种fgd1突变，一种是密码子49移码，另一种是密码子320替换，这两种突变都与其他靶基因的突变同时发生，分别是fbiA的D49T和ddn在nt59-101缺失，但是它们对MIC的影响无法确定[32-35]。

作为辅酶F420生物合成途径的成员，fbiA编码2-磷酸乳酸转移酶，负责将2-二磷酸-5-鸟苷的磷酸乳酯部分转移到FO中[36]，fbiB由两个结构域组成:F420连接酶的N端结构域与硝基还原酶蛋白序列相似的C端结构域[37]，是一种γ-谷氨酞连接酶，通过连续向F420-0添加L-谷氨酸残基来催化F420生物合成途径，产生聚γ-谷氨酸尾部。因此，fbiB突变体产生F420-0，这可能会降低ddn活性，从而可能会导致德拉马尼活性减弱[38]，Hoffmann等[39]研究发现德拉马尼敏感株MIC<0.06 mg/L，耐药菌株的MIC>2.0 mg/L, 这两个菌株也包含fbiA基因R175H变异,而耐药菌株同时发生了D49Y突变，因此fbiA基因D49Y突变可能导致德拉马尼耐药的变异，另一篇全基因组测序分析结核分枝杆菌耐药菌株的研究中发现在表型耐药病例中出现ddn、fgd1、fbiA和fbiC基因突变，ddn过早发生终止密码子突变(Trp88STOP)，仅出现在耐药菌株中;而fbiA突变Arg175His存在于1个耐药菌株和9个易感菌株中。而fbiB的所有突变均仅在德拉马尼敏感株中报道，可能是fbiB突变频率较低的原因[40]。Reichmuth等[29]在未治疗的结核病患者的德拉马尼的耐药中发现了同样的结果，除了fbiB基因未突变，其他4个相关基因均有突变。

fbiC催化羟基苄基从4-羟基苯基丙酮酸转移到嘧啶二酮。Haver等[18]的研究显示在自然产生的对PA-824耐药的突变株中，fbiC中发现了较多的单核苷酸多态性(SNP)多样性，这表明fbiC在硝基咪唑耐药中可能发挥作用。2017年， Pang等[27]研究未经德拉马尼治疗的90株XDR结核分枝菌的体外敏感性，4株耐药菌株ddn、fgd1、fbiA和fbiB均未发生突变，而fbiC基因的318密码子突变(Val318Ile)被鉴定为与德拉马尼耐药相关的唯一突变。

六、总结

在结核分枝杆菌对德拉马尼耐药及其分子机制的研究报道中，由于使用药敏试验方法的不同，以及突变的多样性，任何破坏这些基因功能的突变都可能导致MIC升高[19]。既往的研究只能推测出与耐药的部分相关性。应建立标准化、可重复的药敏试验并开展WGS检测及分子机制的其他研究，进一步了解F420生物合成在德拉马尼耐药中的作用，更好地理解耐药机制和耐药结核分枝杆菌的进化和传播之间的联系，避免耐药性的早期发展和耐药菌株的传播，对于在治疗期间获得性耐药结核病患者，系统性的耐药监测，能为其提供更个性化的治疗。

利益冲突所有作者均声明无利益冲突

作者贡献周明：论文撰写、数据整理和分析；刘皇容：研究指导、数据分析；唐柳生：研究指导、数据分析；刘桑: 研究指导、论文修改；刘爱梅：研究指导、论文修改