甘草养阴汤对老年类风湿关节炎的价值探索*

陈永，陈艳娟，刘冬舟

1 暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院） 广州广东 518000

2 暨南大学基础医学院 广州广东 510632

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎症为病理机制的自身免疫病，其突出病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质，最终导致关节破坏畸形[1]。在发达国家RA患病率为0.5%～1%，中国大陆地区发病率为0.42%。每年新发病RA人数为每5～50人/10万人[2]。在RA患者人群中有一组特殊的人群，即老年RA患者。老年的RA患者包括60岁以后发病的患者和年轻时候发病但是超过60岁的老年人群[3]。由于人口的老龄化以及老年发病率增加，老年的RA患病人群在逐年升高[4]。相对于年轻发病的RA患者，老年发病的RA患者具有发病急、常伴系统损害、功能预后差等特点[5]。另外由于合并症增多，老年RA患者常需要多种药物治疗各种合并症，这使得复杂的RA治疗方案难以优化，并且由于肝和肾功能不全而增加药物相互作用、不良事件和禁忌症的可能性[6]。因此常规的RA达标治疗对于老年患者药物副作用风险面临挑战。临床对老年RA的治疗常常未能达标[7-8]。

中医药控制RA的相关研究也非常丰富。但是在临床实践中，单纯以中药控制RA常难以达到让患者满意的效果。但中医药是基于整体观，在对患者整个机体康复中凸显特色[9-10]，尤其是在与西药联用时，起到减毒增效的作用。显然中药在中西医结合治疗老年性RA患者有一定的优势。前期在研究白塞病的治疗方剂中，发现出自《伤寒杂病论》的甘草泻心汤可用于消化系统、神经系统、免疫系统、内分泌系统、妇科等疾病[11-12]。体现异病同治的效应。在临床实践中，为了降低毒性、使药性更加温和，作者结合中医药理论知识及国内外文献研究结果，对甘草泻心汤进行了改良，使其更适合老年性RA，并将改良后的药方命名为甘草养阴汤（Gancao Nurish-Yin decoction，GCNY）。改良后的配方成分包括：甘草、人参、干姜、蒲公英、罗汉果、玉竹、大枣等7种中药成分（专利申请号：201910843519.9）通过研究显示对RA有效。本研究拟运用网络药理学挖掘GCNY作用于老年RA的靶点并研究其作用的信号通路，为进一步实验研究提供一定的理论依据。

研究方法

1 药物有效成分及作用靶点获取

使用中药系统药理学数据库及分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[13]中检索窗口依次输入中药名称：甘草、人参、大枣、玉竹、罗汉果、干姜，搜索的得到对应的有效化学成分（Mol ID），设置筛选条件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药物特性（Drug-like properties，DL）≥0.18。然后在该平台检索各种化学成分作用的靶点蛋白。利用疾病靶点标准化Uniprot数据库[14]，分别检索上述得到药物潜在靶点蛋白名称，种属设置为“Homo sapiens”，获取其靶点的标准基因名。其中，TCMSP数据库未检索到蒲公英的有效作用成分，遂通过中药综合资源数据库（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[15]共查得蒲公英的基因靶点25个。

2 GCNY药物-成分-靶点网络的构建

将GCNY7种中药对应的有效成分与作用靶点基因导入Cytoscape 3.7.1 软件中，利用软件功能构建药物-成分-靶点网络作用图，在网络图中单味中药种类、有效活性成分和靶点基因用不同形状或者颜色的节点表示。

3 疾病相关基因的筛选

在GeneCards数据库中检索与“衰老（Aging）”及“类风湿关节炎（rheumatoid arthritis）”相关的靶点基因，分别获得26060个、4465个，将这些疾病靶点基因输入计算机R语言中，剔除重复基因名称，选择相关相关系数（“Relevance.score”）大于10的相关基因，最终获得216个衰老相关的基因和393个RA相关基因。

4 GCNY作用于衰老的靶点及信号通路分析

为了进一步探究GCNY与衰老及RA的相互作用关系，在计算机R语言中使VennDiagram包将GCNY靶点基因和衰老或RA相关基因作交集，即获得衰老与RA或者三者的共同靶点基因，并绘制韦恩图。并对获得的交集基因使用R软件中ClusterProfile包中的enrichGO函数对差异基因进行GO功能富集分析和enrich KEGG函数进行信号通路富集分析[17]。

5 蛋白相互作用（PPI）网络的构建

将上述的得到GCNY作用于衰老和RA的交集基因上传至STRING数据平台[18]，选择“multiple proteins”模式，蛋白种属设为“Home sapiens”，建立药物靶蛋白-疾病靶蛋白（PPI）相互作用网络，网络图构建采用默认参数，下载PPI网络图的数据矩阵，并将其输入Cytoscape 3.7.1 软件，绘制GCNY作用于衰老和RA交集靶点的蛋白互作网络图。

结 果

1 GCNY的作用靶点挖掘

GCNY除蒲公英以外共含有有效成分130个，包括蒲公英整个配方成分共涉及靶点277个。将基因靶点上传至 Cytoscape 3.7.1 软件构建药物-成分-靶点网络图（图1）。其中，甘草有效作用成分包括Inermine、Mairin、甘草酚、Jaranol、苜蓿素等88个；作用靶点基因20个，如PIK3、PGR、KDR、NOS2、HTR2A等。大枣有效成分28个如千金藤碱、香豆素、豆甾醇等；作用靶点基因202个，如DRD1、HSP90、CYP3A4、AR、PDE10A等。人参有效作用成分17个，如β-谷甾醇、山奈酚、人参皂苷rh2等；作用基因靶 点231个；如：TNF、IL1B、F10、GSTM1、PRKACA等。罗汉果有效作用成分6个，如邻苯二甲酸2-乙基己酯、黑麦草碱等；作用靶点基因23个，如PTGS1、RXRA等。干姜有效作用成分5个，包括3，4，5，7-四羟基-8-甲氧基黄酮、谷甾醇等；作用基因靶点22个，CDK2等。玉竹有效作用成分6个，如4’，5，7-三羟基-6-甲基-8-甲氧基-高异黄酮、正香豆酰酪胺等；作用靶点基因20个，MAOB、CALM、NOS2等。在TCMSP中未检索到蒲公英有效成分，通过TCMIP数据库，查得蒲公英作用靶点基因25个，包括LSS、VDR、ESR1等。多种成分共可共同调节一些相同的靶点基因。如配方的7种成分均可作用于PGR、NCOA2；除蒲公英外，其余6种成分均可作用于PTGS1、SCN5A、PTGS2、HSP90AA1、PRKACA、NOS2、NR3C2、PDE3A、AR等靶点，见图1。

图1 GCNY药物-成分-靶点相互作用网络图

2 RA与衰老共同基因靶点

通过数据库共获得到RA发病相关基因393个、衰老相关基因216个、RA合并衰老共同基因61个，包 括TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等（图2）。主要参与的信号通路包括：糖尿病并发症中的年龄-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、类 风 湿关节炎（rheumatoid arthritis）、癌症中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）、脂质和动脉硬化（lipid and atherosclerosis）、IL-17信号通路等通路，见图2，图3。

图2 RA与衰老的共同基因靶点及KEGG富集相关通路

图3 RA与衰老的共同基因靶点参与的前20个信号通路

3 GCNY作用与老年RA的基因靶点分析

在RA与衰老的共同参与基因中，可被GCNY作用的基因靶点共26个，包括：VEGFA、MMP9、CCL2、TNF、ALB、IL6、IL1B、MMP2、TP53、IL10、TGFB1、STAT3、CXCL8、PTGS2、NOS2、ESR1、MMP1、ICAM1、IFNG、MAPK1、IL2、COL1A1、IL1A、MPO、CRP、CAT等（图4A，B）。

图4 GCNY潜在作用于RA合并衰老的共同基因靶点

GCNY潜在作用于RA、衰老及RA合并衰老的共同基因靶点；（B）GCNY潜在作用于RA合并衰老的共同基因靶点的蛋白相互作用PPI网络图。

通过GO富集通路分析，GCNY潜在作用于RA合并衰老的共同基因靶点作用于生物学过程的通路包括对氧化应激的反应（response to oxidative stress）、对 细 菌 来 源 的 分 子 的 反 应（resopnse to molecule of bacterial origin）、对 脂 多 糖 的 反 应（response to lipopolysaccharide）、活性氧代谢过程的调 节（regulation of reactive oxygen species metabolic process）；作用于细胞成分的载体腔（veicle lumen）、分泌颗粒腔（secretory granule lumen）、血小板α颗粒腔（platelet alpha granule lumen）；分子功能方面包括：四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、受体配体活性（receptor ligand activity）、过氧化物酶活性（peroxidase activity），见图5。

图5 GCNY潜在作用于RA合并衰老的共同基因靶点的GO通路富集分析

讨 论

RA是最常见的全身性和慢性自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）之一。 除了骨和关节软骨是最易受损害外，其他器官也可能受累并导致多种表现，如贫血、骨质疏松、感染、皮肤或肺损伤[19]。随着慢性炎症被证明是导致衰老和年龄相关疾病发病的机制之一，炎症相关性衰老引起重视[20]。来自临床观察的证据表明患有AID的患者，如RA、系统性红斑狼疮 、强直性脊柱病、白塞氏病都表现出对老年相关疾病（age-related disease，ARDs） 的易感性，尤其是心血管疾病 、糖尿病等[21-22]。对于这一现象的解释是炎症性衰老（inflammation），即炎症及炎症影响了代谢相关生物学过程，进而调控衰老进展[23]。在本研究中，TP53、IGF1、MMP1、MMP9、PTGS2、NOS2、STAT3等61个基因靶点参与RA发病的基因，也被发现是同时参与衰老的相关基因。

在抑制炎症方面，GCNY配方相关的7种植物成分及其单体成分研究比较丰富。如研究显示：甘草查耳酮（Licochalcone A、B、和D）显著抑制LPS诱导的NF-κB转录激活，Licochalcone B和D显着降低LPS诱导的NO，TNF-α和MCP-1的产生[24]；从甘草根中提取的一种天然黄酮类脂蛋白Liquiritin，能显著抑制IL-1β诱导的RA-FLS的增殖、促进核DNA片段化、并改变线粒体膜电位以加速细胞凋亡、Liquiritin通过下调Bcl-2/Bax的比例，并抑制VEGF的表达以及JNK和P38的磷酸化，显示改善了RA炎症浸润和血管生成的临床评分、并在体内诱导了滑膜组织的细胞凋亡[25]。大量研究证明了人参和人参皂甙的抗炎特性，它们对RA发病机理的改善作用。如化合物K（compound K，CK）通过抑制Janus激酶（JAK）和细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导途径，显着降低了RA成纤维样滑膜细胞MMP-1和MMP-3的产生；人参皂甙Rb1（G-Rb1）显著抑制了干扰素-γ诱导的人RA患者外周血单个核细胞、软骨细胞和成纤维样滑膜细胞中TNF-α的表达[26]。从中草药蒲公英中分离出来的一种生物活性五环三萜类化合物之一的蒲公英醇（taraxasterol，TAR）显著抑制CIA小鼠中IL-1β诱导的促炎性细胞因子表达，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-8、以及基质金属蛋白酶（MMP）的产生[27]。同样，在体内和体外实验中大量研究证实GCNY配伍中的其它植物成分，如罗汉果、玉竹、大枣和干姜所含有的成分同时具有抑制炎症反应的作用和抗衰老的作用。

通过网络药理学数据挖掘，GCNY作用于RA和衰老的共同靶点基因26个，其中细胞因子通路、细胞因子受体、趋化因子受体和抗氧化通路等是重要的靶基因富集通路。当然GCNY的功效和潜在机理是网络药理学不能完全诠释的。如GCNY中，甘草益气补中，清热解毒为君药；人参补气、生津，玉竹养阴润燥，协调甘草作用，并消除其水钠潴留的副作用，为臣药。蒲公英、罗汉果清热解毒，干姜温中散寒，回阳通脉，属于佐药；大枣养血安神、缓和药性为使药。整个配方阴阳调和、滋阴为主，阴中求阳；对机体的阴阳失调形成了“缓冲液”一样的作用。而这些是无法通过网络药理学进行论证的。中西医结合治疗老年类风湿关节炎是体现中医优势、提高患者疗效的可靠途径，我们将进一步通过基础及临床研究对GCNY作用机制及疗效评价进行研究开发。