木瓜-淫羊藿药对治疗腰椎间盘突出症的作用机制探究*

王攀，唐成剑，周长征

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410007

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）又称腰椎间盘纤维环破裂髓核突出症，是指因腰椎间盘发生退变，纤维环和髓核含水量减少，髓核失去弹性，在外力作用下使纤维环破裂、髓核突出，刺激或压迫硬脊膜及神经根，而引起以腰痛及下肢坐骨神经放射痛为特征的疾病[1]。其临床表现多以腰痛、下肢疼痛、马尾神经症状为主。LDH的发病机制主要包括椎间盘退变、机械应力损伤、免疫炎症、细胞外基质代谢失衡等[2]。本病好发于20～40岁青壮年，男多于女，是临床最常见的腰腿痛疾患之一。下腰部是全身应力的中点，负重及活动度大，损伤概率高，是LDH的好发部位。其中以L4-5椎间盘发病率最高，L5-S1椎间盘次之。西医对于本病主要采用改善循环、消炎镇痛、脱水消肿、营养神经等对症支持治疗，严重时需配合手术治疗。而临床上绝大多数患者不具有明显的手术指征，相比之下，中医中药治疗本病得到了广泛的认可。

中医学将LDH归属于“腰痛”“痹证”的范畴。病证具有本虚标实的特点。其病因病机在于肝肾不足，筋骨不健，复受扭挫，或感受风寒湿邪，经络痹阻，气滞血瘀，不通则痛。病延日久，则气血亦虚，瘀滞凝结，缠绵难愈[3]。木瓜，其性温，味酸，归肝、脾经，长于舒筋活络、和胃化湿，善于治疗湿痹、筋脉拘挛、腰膝酸重疼痛；淫羊藿，其性温，味辛、甘，归肝、肾经，长于补肾阳、强筋骨、祛风湿，善于治疗肾虚筋骨萎软、风寒痹痛。《本草正义》[4]云淫羊藿善于走窜，其性走而不守，对于风寒湿三气侵袭筋脉、阻滞经络、关节活动屈伸不利等症尤为适宜；二药相配伍，标本兼治，刚柔并济，常作为药对用于痹证的治疗。现代研究[5]表明，木瓜苷可以抑制NF-κB P65和TNF-α的表达，从而减缓炎症反应和细胞凋亡。淫羊藿可提高退变椎体骨组织Ca和P的含量，下调血清中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的水平，具有阻止炎性反应和抑制椎间盘退变的作用[6]。因此，本文应用网络药理学的方法，从分子水平初步阐明木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的潜在作用机制，为后续的研究奠定基础。

材料与方法

1 “木瓜-淫羊藿”药对有效成分的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform）上检索出木瓜-淫羊藿的所有化学成分。生物利用度（Oral bioavailability，OB）是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度与程度，是反映所给药物进入人体循环的药量比例。类药性（drug-likeness，DL）指化合物与已知药物的相似性。具有类药性的化合物并不是药物，但具有成为药物的可能。将OB≥30%和DL≥0.18作为条件，筛选出药对的有效成分。

2 药对有效成分的靶点预测与基因注释

通过TCMSP预测木瓜-淫羊藿有效成分的对应靶点，并通过Perl软件和Universal Protein数据库对预测出的靶点进行基因注释。

3 疾病靶点和木瓜-淫羊藿药对靶点基因交集

在GeneCards数据库和OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）数 据 库 中，以“Lumbar disc herniation”作为关键词进行检索，剔除两个数据库中得到的相同的靶点基因，从而得到疾病的靶点基因。再利用R软件将疾病的靶点基因与木瓜-淫羊藿药对的靶点基因进行交集分析，并绘制出韦恩图。

4 构建中药调控网络

将木瓜-淫羊藿药对的有效成分及对应的靶点基因与刚获得的交集靶点基因等数据导入Cytoscape软件，构建药物-有效成分-共同靶点基因-疾病网络。

5 构建蛋白互作（PPI）网络

将木瓜-淫羊藿药对与疾病的共同靶点基因导入String软件，物种选择为“Homo sapiens”，设置最小互作力为0.4，隐藏多余的点，构建蛋白互作（PPI）网络，并导出相关的数据文件，运用R软件对刚导出的PPI网络数据文件进行分析，并绘制出PPI网络条形图。

6 GO和KEGG富集分析

将木瓜-淫羊藿药对与疾病的共同靶点基因等数据导入R软件，进行GO富集分析和KEGG富集分析，并绘制出柱状图和气泡图，得到可能相关的作用通路图。

结 果

1 “木瓜-淫羊藿”药对有效成分获取结果

在TCMSP数据库分别以“木瓜”、“淫羊藿”为检索词进行检索，并以OB≥30%、DL≥0.18作为标准进行筛选，删掉重复数据，最后得到药对有效成分一共26个，其中木瓜4个，淫羊藿22个，见表1。

表1 木瓜-淫羊藿药对有效成分

2 药对有效成分靶点预测结果

在TCMSP数据库中预测药对有效成分的对应靶点，再通过Perl软件和Universal Protein数据库对预测出的靶点进行基因注释，删除重复靶点，最后得到药对有效成分对 应靶点一共403个，其中木瓜141个，淫羊藿262个。

3 疾病靶点和木瓜-淫羊藿药对靶点基因交集结果

在GeneCards和OMIM数据库中检索到“Lumbar disc herniation”相关的靶点基因，剔除两者中相同的靶点基因后获得461个疾病靶点基因，利用R软件将疾病的靶点基因与木瓜-淫羊藿药对的靶点基因进行交集分析，得到51个交集靶点基因，并绘制出韦恩图（见图1）。

图1 疾病与木瓜-淫羊藿药对靶点基因韦恩图

4 中药调控网络构建结果

通过Cytoscape软件对木瓜-淫羊藿药对的有效成分及对应的靶点基因与交集靶点基因进行分析，得到药物-有效成分-共同靶点基因-疾病网络图（见图2）。如图所示，六边形代表药对木瓜-淫羊藿（MY），三角形代表药对木瓜-淫羊藿的有效成分，菱形代表疾病LDH（Lumbar disc herniation），椭圆形代表疾病LDH与药对木瓜-淫羊藿的共同靶点基因。由图得知，药对木瓜-淫羊藿主要通过18个有效成分共同作用于51个靶点基因，从而进一步调控疾病LDH的发生发展。

图2 药物-有效成分-共同靶点基因-疾病网络图

5 蛋白互作（PPI）网络构建结果

通过String软件构建出木瓜-淫羊藿药对治疗LDH相关靶点基因的蛋白互作（PPI）网络图（见图3）。运用R软件对导出的PPI网络数据文件进行分析，筛选出其主要的靶点基因，并绘制出PPI网络条形图（见图4）。其中Degree值排在前5的靶点基因作为核心靶点基因，分别是白细胞介素-6（IL6）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、白细胞介素-1β（IL1B）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）。这充分表明此5个靶点可能是木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的关键靶点。

图3 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH相关靶点蛋白互作（PPI）网络图

图4 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH靶点互作关系barplot图

6 GO富集分析结果

将木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的核心靶点基因导入R软件进行GO富集分析，得到GO柱状图（见图5）和GO气泡图（见图6）。图中木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的核心靶点基因的GO功能主要包括细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、受体-配体活性（receptor ligand activity）、信 号 受 体 激 活 剂 活 性（signaling receptor activator activity）、丝氨酸水解酶活性（serine hydrolase activity）、生长因子受体结合（growth factor receptor binding）、内肽酶活性（endopeptidase activity）、丝氨酸型内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、丝氨酸型肽酶活性（serine-type peptidase activity）、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway）、整合素结合（integrin binding）、生长因子活性（growth factor activity）、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程（cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）、MAP激酶活性（MAP kinase activity）、激酶调节活性（kinase regulator activity）、血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合（RNA polymerase II-specific DNAbinding transcription factor binding）、激 酶 激 活 因 子（kinase activator activity）、蛋白激酶调节活性（protein kinase regulator activity）等。柱状图和气泡图左侧为GO名称；柱状图下面的数字及气泡图中气泡的大小表示富集在GO上的基因数量，数字及气泡越大，表示富集基因越多；右侧的p.adjust表示富集程度，其值越小，表示富集程度越高，对应柱状图和气泡图的颜色也就越红。

图5 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的GO柱状图

图6 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的GO气泡图

7 KEGG富集分析结果

将木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的核心靶点基因导入R软件进行KEGG富集分析，得到KEGG柱状图（见图7）和KEGG气泡图（见图8）。图中木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的核心靶点基因的KEGG通路主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信 号 通 路（IL-17 signaling pathway）、肿 瘤 坏死 因 子 信 号 通 路（TNF signaling pathway）、恰 加 斯病（Chagas disease）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、松弛素信号通路（Relaxin signaling pathway）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、百 日 咳（Pertussis）、类 风 湿 性 关 节 炎（Rheumatoid arthritis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、膀胱癌（Bladder cancer）、前 列 腺 癌（Prostate cancer）、癌 症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）、甲型流感（Influenza A）、C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、耶尔森菌感染（Yersinia infection）、利什曼病（Leishmaniasis）等。与GO富集分析类似，柱状图和气泡图左侧为KEGG名称；柱状图下面的数字及气泡图中气泡的大小表示富集在KEGG上的基因数量，数字及气泡越大，表示富集基因越多；右侧的p.adjust表示富集程度，其值越小，表示富集程度越高，对应柱状图和气泡图的颜色也就越红。结果显示富集程度最高的靶点通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications），进一步绘制出其相关的作用通路图（见图9）。

图7 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的KEGG柱状图

图8 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的KEGG气泡图

图9 木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的AGE-RAGE信号通路图

讨 论

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定的信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。随着医药研究的不断深入和疾病谱的变化，中药在近些年对于疾病的防治上展现出其独特的魅力。通过检索中药多成分、多靶点，筛选出中药的有效活性成分，阐明中药的作用机制，强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用，对科研具有重要的指导意义[7]。加味独活寄生合剂是湖南中医药大学第一附属医院骨伤科结合多年临床经验在独活寄生汤原方基础上加制南星、黄芩、木瓜、淫羊藿而成，大量前期研究[8-11]表明，其对膝骨关节炎具有显而易见的疗效。关于独活寄生汤治疗腰椎间盘突出症的文献研究目前已较完善，也有文献[12]报道，加味独活寄生合剂对腰椎间盘突出症亦具有明显疗效。而木瓜-淫羊藿补益肝肾、活络化湿，对于腰椎间盘突出症有一定的治疗作用。

通过蛋白互作（PPI）网络图可知，木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的5个核心靶点基因分别是白细胞介素-6（IL6）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）、白细胞介素-1β（IL1B）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）。研究[13]显示，LDH患者的血清中IL-6等炎症因子明显高于正常人，故LDH的发病可能与炎症因子相关。李洪涛[14]等通过对60例LDH患者的血清进行分析，发现IL-6是重要的炎症因子，可以通过降低基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的活性并抑制其合成。而TIMP-1的减少又会引起椎间盘基质内蛋白相关生物的改变，从而使纤维环变薄并且失去弹性，在内外因的作用下，髓核突出压迫硬膜囊和神经根，导致LDH的发生。MMP-9是金属基质蛋白酶的一种，其可降解蛋白多糖聚合体以及纤维连接蛋白，从而加快椎间盘的退变[15]。IL-1β既是炎症因子，又是致痛物质，可促进蛋白多糖的降解，增加血管通透性，影响髓核细胞的正常代谢，加速纤维环细胞的凋亡[16]。退变的椎间盘也会释放IL-1β等，在炎症因子的刺激下，加快腰椎间盘突出症的发生发展，从而引发腰腿痛等一系列症状，形成一个恶性循环[17]。李晓春[18]等将63只雄性SD大鼠随机分为三组，将取得的大鼠椎间盘做VEGF免疫组化。结果表明突出的椎间盘组织中有VEGF的表达，并在腰椎间盘破裂型突出后重吸收中起重要作用。VEGF水平的增加可刺激椎间盘表面的血管新生，将自身的抗原和炎性因子更多的吸收入血，加重机体的炎症反应[19]。魏明[20]等将54只大鼠随机分为假手术组、模型组、溶剂组、AMD3100组、SDF-1中和抗体组、对照Ig G组。通过鞘内注射相应药物，测量大鼠脊髓中pAKT的表达。结果鞘内注射SDF-1中和抗体或CXCR4抑制剂AMD3100升高髓核自体移植大鼠脊髓中pAKT表达下调（P<0.05）。该研究说明了SDF-1/CXCR4通过激活PI3K/AKT通路介导髓核致炎根性疼痛。以上均从炎性致病学说层面进行阐述，充分体现出其与LDH的相关性。

上述研究表明，木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的信号通路主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、恰加斯病、流体剪切应力与动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路等。相关研究[21]提示，IL-17是一种前炎性细胞因子，其可以诱导和活化T细胞，刺激巨噬细胞、成纤维细胞等释放其他促炎性因子；其次也是炎症反应的微调因子，IL-17常与其他炎症因子相互作用，导致机体炎症反应的发生。如IL-17能够增加人成纤维母细胞黏附分子-1 （ICAM-1） 的表达，刺激上皮细胞、内皮细胞或成纤维细胞产生IL-6、IL-8、G-CSF[22]，并通过ICAM-1使椎间盘内的淋巴等免疫细胞聚集起来，引起相关的免疫应答反应[23]。故IL-17以直接或间接的方式，打破原有的椎间盘内环境的代谢平衡，诱导相应的细胞凋亡，加剧椎间盘的退变。TNF-α又称恶质素，主要由单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞产生[24]，在椎间盘的退变中起到多重作用。大量研究[25-26]证实，体内TNF-α水平越高，椎间盘退变的程度就越严重，即TNF-α与椎间盘退变成正相关。再者，TNF-α具有对椎间盘突出组织的重吸收作用。在TNF-α的作用下，基质金属蛋白酶的活性和基因表达加快，从而减少胶原和蛋白多糖的合成；同时激活NF-κB和MAPK信号分子通路，促进椎间盘组织细胞基质的降解，加剧炎症反应，改变内皮细胞的通透性，间接利于椎间盘突出组织的重吸收[27]。已有研究[28]表明，TNF-α抑制剂在一定程度上可减缓椎间盘疾病的进程。TLR是一类具有信号转导功能的跨膜受体蛋白，其具有不同的亚型，分别分布于不同的免疫细胞中，通过识别特异性的信号分子，激活对应的信号通路，最终介导炎症与疼痛反应的发生[29]。木瓜-淫羊藿药对可能通过这些信号通路调节炎症反应及细胞的增殖、分化与凋亡，从而起到治疗LDH的作用，有些信号通路的相关报道尚显不足，有待进一步深入研究。

小 结

综上所述，木瓜-淫羊藿药对可能通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、恰加斯病、流体剪切应力与动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路等多个途径作用于白细胞介素-6、基质金属蛋白酶-9、白细胞介素-1β、血管内皮生长因子A、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等靶点参与调节炎症反应及细胞的增殖、分化与凋亡，从而起到防治LDH的作用。本研究是基于网络药理学初步阐述木瓜-淫羊藿药对治疗LDH的可能作用机制，对后期的药效及临床研究均具有一定的指导意义。但网络药理学的疾病谱、基因谱及相关的算法均不够全面，为取得可靠的突破性成就，仍需后续广泛而又深入的研究。